GPCR와 PROTAC: 보다 효과적인 약물 후보물질을 디자인하기 위한 새로운 접근 방법

게시일 : 2022년 02월 23일

G protein-coupled receptors (GPCRs)는 세포막을 7번 가로지르는 독특한 구조적 특성을 특징으로 하는 cell surface receptor의 큰 그룹에 포함됩니다. 그리고 GPCR은 펩타이드, 신경전달물질(neurotransmitter), 사이토카인(cytokine), 호르몬, 기타 small molecule 등의 다양한 신호 전달 물질들과 반응합니다 (1). 활성화된 GPCR은 GTP-binding (G) protein과 arrestin과 결합하여 다양한 신호 전달 경로를 조절합니다. 이와 같은 광범위한 기능으로 인해 GPCR은 약물 개발의 주요 타겟입니다. 2012년에 Robert Lefkowitz와 Brian Kobilka가 “G-protein–coupled receptors 연구”로 노벨 화학상을 수상하면서 GPCR 연구의 중요성이 강조된 바 있습니다.

GPCR은 구조 및 기능에 따라 A~F의 6개 class로 분류됩니다. Class A GPCRs인 rhodopsin-like receptor는 여러 질환과 연관되어 있어 많이 연구되고 있습니다 (2). Class A GPCRs은 고도로 보존된 구조적 motif를 가지고 있으며 (3) chemokine (특히 백혈구의 세포 이동을 자극하는 작은 크기의 “chemotactic cytokine”)에 반응하는 그룹입니다 (4). Class A subfamily의 GPCRs은 N-말단 근처에 두 개의 cysteine 잔기가 있는 chemokine인 CC chemokine에 반응합니다. CC chemokine에 의해 활성화되는 GPCRs을 CC chemokine receptors (CCRs)라고 하며, 이 CC chemokine과 CCRs의 interaction은 pro-cancer와 anti-cancer pathway 모두와 관련되어 있습니다.

약물 개발 타겟으로서의 GPCR

GPCR을 타겟으로 하는 대부분의 약물 개발 과정에서는 특정 타겟 GPCR에 높은 affinity를 가지는 small molecule 화합물 (GPCR agonist 또는 antagonist)을 이용합니다. 하지만, in vitro 또는 컴퓨터 모델링을 통해 확인된 높은 affinity 결과가 임상시험에서 항상 높은 효능으로 나타나지는 않습니다.

예를 들어, Huber 연구팀은 특성이 잘 규명된 chemokine receptor CCR9의 small molecule inhibitor를 연구하였습니다 (6). Friedrich-Alexander-Universität (FAU) Erlangen-Nürnberg의 의약화학 책임자(Chair of Medical Chemistry)인 Matthias Schiedel 박사는 “CCR9의 endogenous ligand인 chemokine CCL25에 의한 CCR9 활성은 백혈구 recruitment에 핵심적인 역할을 합니다.”라고 말합니다. Schiedel 박사는 이 논문의 교신저자(corresponding author)로, CCR9-mediated signaling의 조절 이상이 크론병(Crohn’s disease) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 비롯한 염증성 질환의 발병기전과 관련이 있다고 설명하면서“CCR9는 염증성 장질환 치료(inflammatory bowel disease)의 잠재적인 약물 타겟으로 주목받고 있습니다.”라고 말하였습니다. 또한 최근에는 COVID-19 치료에 있어 잠재적 타겟으로 제안된 바 있습니다 (7).

연구팀은 기존에 CCR9에 대한 높은 affinity을 보였으나 크론병 3상 임상시험에서 효과가 없는 것으로 입증된 버시논(vercirnon) 화합물을 연구하였습니다 (8). Schiedel 박사는 버시논의 낮은 용해도 (9), 알부민에 대한 비아릴 케톤 약물작용발생단(biaryl ketone pharmacophore)의 공유 결합(covalent binding) (10) 등을 이러한 결과의 잠재적 원인일 것이라 언급하였습니다. 또한 제2상 임상시험 (11)과 비교하였을 때 모집한 시험 대상자의 개별적 차이가 결과에 영향을 미쳤을 수 있습니다.

CCR9와 버시논의 결합(engagement)을 측정하기 위한 기존의 연구에서는 확립된 radioligand binding cell-free assay를 사용한 바 있습니다 (12). FAU의 연구원이자 의약화학 책임자이며 본 연구의 공동 저자인 Dorothée Weikert 박사는 "radioligand binding assay는 heterogeneous assay 프로토콜을 기반으로 되어 있기 때문에 측정 전 결합되지 않은 방사성 리간드 분획(radioligand fraction)을 제거해야 합니다."라고 설명하며 (6), "그래서 radioligand binding assay는 연속적인 측정이 불가능하며 쉽게 규모를 줄일 수도 없습니다."라고 덧붙였습니다. 또한 이러한 assay에는 radioactive tracer 사용 시 발생하는 단점인 방사선 보호 조치 및 폐기물 처리에 대한 높은 인프라 비용이 수반됩니다.

Inhibitor가 아닌 Degrader

연구자들은 CCR9의 intracellular allosteric binding site (IABS)를 타겟으로 하는 좀더 우수한 약물 개발 옵션을 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 고려하였습니다. 연구팀은 NanoBRET™ technology를 사용하여 cell-based, kinetic binding assay에서 여러 화합물을 평가한 후 형광 라벨된 버시논 유사체인 tracer를 개발하였습니다.

Weikert 박사는 “NanoBRET™ 기술의 주요 장점은 low volume assay 디자인 (384-well plate)과 반복적인 assay 결과 측정이 가능하다는 점입니다.”라고 말합니다. 따라서 연구팀은 CCR9에 결합하는 형광 라벨된 버시논 유사체 (tracer)의 real-time kinetics를 high-throughput format으로 측정할 수 있었습니다. 이 연구에서 CCR9와 버시논 scaffold의 interaction은 긴 residence time이 유지되는 것을 확인하였으며, 이 결과는 버시논의 높은 affinity과 탁월한 CCR9 selectivity를 설명해줍니다 (6). NanoBRET™ 기술은 세포막으로 준비된 샘플에서, 그리고 온전한 live cell상태에서 모두 사용할 수 있기 때문에, 이 방법을 통해 “새로운 화합물이나 fragment가 세포막을 통과하여 살아있는 온전한 세포의 세포내 타겟에 도달되는지에 대한 직접적인 정보를 얻을 수 있었습니다.”라고 Weikert 박사는 설명하였습니다. NanoBRET™ 스크리닝 플랫폼을 사용한 추가적인 kinetic 측정을 통해 새로운 세포 내 CCR9 리간드를 식별할 수도 있었습니다. 흥미롭게도, 스크리닝 실험에서 CCR9의 IABS가 hetero-bifunctioƒnal ligand와 결합이 가능하다는 것을 보여주었습니다 (6). 이는 hetero-bifunctional PROTAC의 적합한 약물 타겟 site로 작용할 수 있기 때문에 이로 인해 CCR9를 파괴하는 targeted protein degradation (TPD)이라는 CCR9 inhibitor설계와 관련된 흥미로운 대안을 제시하였습니다. "일반적으로 PROTAC은 standard inhibitor에 비해 우수한 in vivo 효능을 나타냅니다."라고 Schiedel 박사는 말합니다. 이러한 in vivo 효능은 비가역적인 타겟 단백질의 분해에 의해 나타나는 약리학적 효과로부터 기인합니다. 그는 "PROTAC 분자 하나는 여러 개의 타겟 단백질 분해를 유도할 수 있기 때문에" 이러한 촉매 작용은 이점이 된다고 덧붙였습니다. 또한, Weikert 박사는 "단백질 분해는 plasma membrane의 receptor 신호 전달을 억제하거나 allosteric modulation보다 세포 기능에 더 많은 영향을 줄 수 있습니다."라고 설명합니다. 연구팀은 CCR9 inhibitor인 버시논-derived PROTAC인 CRR9 degrader에 대한 proof-of-principle 연구를 수행하였습니다. 이 CCR9 degrader는 1 – 25nM에서 세포내 CCR9을 감소시킴을 ELISA 방법을 통해 확인하였습니다. 또한, CCR9 분해는 ubiquitination과 이어지는 proteasome 분해 과정을 억제하는 NEDD8-activating E1 enzyme inhibitor인 MLN4924에 의해 감소하였습니다 (13). Schiedel 박사는 occupancy-driven 단백질 기능 inhibitor (예: 버시논)의 치료 효능이 제한적인 CCR9의 경우 "PROTAC 전략을 적용하여 이러한 한계를 극복할 수 있을 것으로 기대됩니다."라고 결론지었습니다.