qPCR: 매우 기본적인 부분들(qPCR의 Basic)
기존의 end-point PCR에 익숙한 연구자들에게는 real-time PCR 혹은 quantitative PCR(qPCR)을 이해하고 적용하는 것이 어려울 수 있습니다. 이번 포스팅에서는 qPCR의 기본 원리, qPCR 실험 셋팅 방법, 실험 진행 시 고려해야 할 사항들을 설명하고자 합니다.
먼저 end-point PCR과 qPCR을 아래의 테이블을 통해 비교해 보겠습니다.
| End-Point PCR | qPCR |
| PCR 반응 완료 후, 증폭된 산물을 agarose gel에서 전기영동을 통해 band로 확인함 | Detection 장비를 통해 실시간으로 (real-time) 증폭되는 결과를 보여줌 |
| 사용한 DNA 또는 RNA양을 정확하게 측정하지 못함 | 사용된 DNA 또는 RNA copy 수 측정이 가능함 (quantitative = qPCR) |
| 낮은 비용; 전용 장비가 필요하지 않음 | 상대적으로 높은 비용; 전용 장비가 필요함 |
| 기초적인 분자생물학 기술이 요구됨 | 좀 더 복잡한 실험적 기술이 요구됨 |
qPCR은 기존의 end-point PCR과 마찬가지로 DNA polymorphism 분석, cloning 또는 분석을 위한 저농도 염기서열, 증폭 병원체 검출 등과 같은 연구 목적에 사용될 수 있습니다. 그러나 qPCR은 end-point PCR과 달리 증폭 과정을 실시간으로 관찰할 수 있고 초기 물질의 copy 수를 측정할 수 있어 유전자 발현 정량, DNA 손상 측정, 샘플 내 바이러스 양의 정량 분석 등 다양한 application에 사용될 수 있습니다.
샘플 내에 오염 물질이 존재하는 경우에는, 타겟 유전자가 기하급수적으로 증폭될 뿐만 아니라 오염 물질도 함께 증폭될 수 있습니다. qPCR은 end-point PCR보다 훨씬 더 민감하기 때문에 오염에 더 큰 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 오염 물질을 제거하는 것은 신뢰할 수 있는 qPCR 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다.
- 에어로졸 방지용 피펫 팁을 사용하고, 증폭 전과 후에 사용하는 피펫과 팁을 구분하세요.
- 실험 시 장갑을 착용하고, 오염 시에는 바로 교체하세요.
- 증폭 전과 후의 과정은 별도의 지정된 구역에서 준비하세요.
- "Master Mix"를 사용해서 실험의 변동성을 최소화하세요. Master Mix는 여러 반응을 위해 (primer와 샘플을 제외한) PCR 반응 구성 요소를 혼합하여 만든 ready-to-use 혼합물입니다. PCR 반응용 혼합물을 준비할 때, 반응 수 보다 약간 더 많은 용량을 한 번에 준비함으로써 피펫팅 에러로 인한 well 간의 오차를 줄일 수 있습니다.
- Primer의 냉동-해동 반복을 최소화하고 stock이 오염될 가능성을 줄이도록 primer를 소분하여 보관하세요.
이는 end-point PCR과 qPCR에 대한 매우 기본적인 팁이지만, 올바르게 이해하고 실험을 진행한다면 실험 목표에 상관없이 성공적인 시작을 할 수 있습니다.
게시일: 2019년 08월 02일