pGEM-T Vector를 이용한 Cloning: Ligation

PCR product를 포함한 blunt-ended DNA 조각을 cloning 하는 가장 쉬는 방법은 pGEM®-T 또는 pGEM®-T Easy Vector Systems 과 같은 T-vector cloning입니다. 이 방법은 Taq DNA Polymerase 와 같은 PCR 효소에 의해 추가되는 "A" overhang을 이용하는 것입니다. T-vector는 insert DNA의 A overhang과 결합되도록 3’ 말단에 T-overhang을 추가한 선형 플라스미드(linearized plasmid)입니다. Insert DNA는 T4 DNA ligase 에 의해 T-tail이 있는 플라스미드 vector에 ligation됩니다. 이 insert는 T-vector의 multi-cloning site에 존재하는 restriction site를 통해 T-vector에서 다른 플라스미드로도 쉽게 이동시킬 수 있습니다.

Pfu와 같은 proofreading polymerase는 “A” overhang을 추가하지 않기 때문에 이러한 polymerase의 반응에 의해 생성된 PCR product는 blunt-end를 갖게 됩니다. 이전 게시글에서, blunt-ended DNA 조각에 A-tail을 추가하는 간단한 방법을 다뤘다면 이번에는 그 다음 단계인 ligation에 관하여 이야기하고자 합니다.

Ligation 준비

Blunt-ended insert DNA (PCR product, 제한효소 digestion 산물, 혹은 sheared and blunted genomic DNA)가 있다면, 해당 DNA 조각에 A-tailing을 추가하여 T-vector (예시, pGEM®-T Easy Vector) cloning을 준비합니다. 그 다음, 정제된 insert DNA 소량과 cloning vector를 준비된 DNA ligase , buffer, ATP와 함께 mixing해 줍니다.

준비된 insert DNA의 농도는 spectrophotometry를 사용하여 측정하거나 agarose gel에서 PCR product와 유사한 크기의 농도가 알려진 DNA molecular weight standard를 이용하여 PCR product의 staining intensity와 비교하여 측정합니다. Vector DNA의 농도를 모르는 경우에도, insert DNA의 농도를 측정한 동일한 방법으로 vector 농도를 측정합니다.

최적의 vector와 insert의 비율을 결정하기 위해서 다양한 vector와 insert의 비율로 테스트하는 것이 필요합니다. 주의해야 할 점은 vector:insert 비율은 insert의 크기에 따라서 달라진다는 점입니다. 대부분의 경우, vector:insert의 molar ratio가 1:1 또는 1:3일 때 잘 반응하지만 1:5, 5:1, 심지어 10:1까지 고려해야 하는 경우도 있습니다. Vector:insert의 molar ratio에 따라 필요한 insert의 양을 계산하는 식은 다음과 같습니다.

Example:
Vector:insert = 1:3으로 ligation 할 때, 3.0kb vector 100ng에 500bp insert DNA를 얼마나 넣어 주여야 할까요?

Answer : [(100ng vector × 0.5kb insert) ÷ 3.0kb vector] × (3 ÷ 1) = 50ng insert

이 계산이 어려우신가요? 어려워 보이더라도 걱정하지 마세요. Promega BioMath Calculators를 활용해 보세요.

Ligation관련된 더 자세한 내용을 알고 싶다면, 아래의 영상을 확인하세요.

Blunt-ended PCR product에 A-tail 추가하는 방법

3’ 말단에 단일 A 염기를 추가하는 nonproofreading DNA polymerase와 PCR product, dATP를 함께 incubation 함으로써 A tail을 생성할 수 있습니다. 제한효소로 잘린 blunt ended DNA 조각에도 이러한 방법을 이용해 A-tail을 추가할 수 있습니다. 아래의 방법은 GoTaq Flexi DNA Polymerase (Mg-free reaction buffer와 같이 제공됨)를 이용한 방법이며 다른 Taq polymerase도 사용할 수 있습니다.

아래와 같이 thin-walled PCR tube에 반응을 준비합니다.

1-4 µl purified blunt-ended DNA 조각 (PCR product 혹은 blunt end를 생성하는 제한효소로 자른 DNA)
2 µl GoTaq Flexi DNA Polymerase Reaction Buffer (Colorless or Green)
2 µl 1mM dATP (final concentration 0.2mM)
2 µl GoTaq Flexi DNA Polymerase (5u/µl)
0.6 µl 25mM MgCl₂ (final concentration 1.5mM)
Nuclease-free water를 이용하여 최종 volume을 10 µl로 맞춤

위에서 준비된 tube를 70°C로 세팅된 water bath 혹은 thermal cycler에서 15-30분간 반응시킵니다. Tailing 반응 완료 후, 별도의 cleanup 없이 1-2 µl를 사용하여 pGEM-T 또는 pGEM-T Easy Vector와 ligation 합니다.

T-Vector cloning을 위한 유용한 팁

다음은 T-vector cloning을 하는 동안 유념해야 하는 사항들입니다.

Nuclease는 T-vector의 T overhang을 절단할 수 있습니다. Ligation 실험 시에는 반드시 멸균된 nuclease-free water를 사용해야 합니다.
Transformation 효율이 높은 competent cells (≥1 × 10⁸cfu/μg DNA)을 사용해야 합니다. 단일 염기 overhang DNA 조각을 ligation은 효율이 높지 않을 수 있기 때문에, 적절한 수의 colony를 얻기 위해서는 transformation 효율이 좋은 competent cell을 사용하는 것이 바람직합니다.
Pyrimidine dimer가 형성되지 않도록 PCR product이 짧은 파장의 UV light에 노출되지 않도록 주의해야 합니다. 이를 위해 agarose gel과 UV source 사이에 유리판을 두고 DNA를 확인하고 가능하다면, PCR product를 긴 파장의 UV light를 이용하여 확인하시기 바랍니다. 또는 Diamond® Nucleic Acid Dye 와 같은 UV를 사용하지 않고 PCR product를 확인할 수 있는 시약을 사용하기 바랍니다.

Cloning에 대한 자세한 내용은 Subcloning Technology Guide e를 참조하세요.

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작성일 : 2020년 1월 8일

작성자 :

Leah Cronan

Leah is a Product Specialist at Promega, managing the Molecular Cloning Products. She earned her BS in Microbiology and a Minor in Spanish at the University of Wisconsin Milwaukee, and her MS in Bacteriology studying alternatives to antibiotics at the University of Wisconsin Madison. She fell in love with microbiology in 9th grade after reading The Hot Zone by Richard Preston. She also very much enjoys documentaries, landscape embroidery, backpacking, baking, and puns. She makes horrible science puns, but only periodically.