30 Years of Bioluminescent Technology Innovations

Luciferase Assay System

처음으로 출시한 Luciferase detection reagent는 감도 높은 비방사성(non-radioactive) firefly luciferase reporter gene assay 제품입니다. LAR assay는 강한 빛이 생성되고 빛의 half-life가 짧은 flash signal 제품으로 현재까지 판매되고 있습니다. Firefly luciferase (luc) reporter 유전자와 LAR assay는 연구자들이 유전자 발현 조절인자를 확인할 수 있는 최초의 실험 방법입니다.

Dual-Luciferase® Reporter Assay System (DLR)

Dual-Luciferase Reporter Assay System은 단일 샘플에서 두 개의 reporter를 순차적으로 측정할 수 있는 최초의 시약입니다. 이는 luciferase 활성의 internal normalization을 제공하므로 reporter assay 결과에 대한 신뢰도를 향상시키는데 중요한 역할을 하였습니다.

pGL4 Luciferase Reporter Vectors

pGL3 reporter vector 제품군은 변형된 firefly luciferase gene인 luc+를 사용하였습니다. 그리고 bioinformatics와 synthesis를 통해 pGL4 vector와 luc2 firefly reporter gene으로 엔지니어링하여 성능 향상을 가져왔습니다.

ENLITEN®/Ultra-Glo™ Recombinant Luciferase

초기에는 재조합 firefly luciferase (Enliten)을 제공하였으나 유도진화(directed evolution)를 통해 온도에 안정적인 luciferase인 Ultra-Glo를 개발하였습니다. Ultra-Glo 개발로 인해 one-step & add-and-read 방법의 다양한 assay 개발과 보관이 가능하게 되었습니다.

Bright-Glo™ (1999), Steady-Glo® (1998), Dual-Glo® (2001) Luciferase Assay Systems

발광 half-life가 짧은 flash kinetics를 변경할 수 있는 새로운 방법의 개발을 통해 firefly luciferase 측정 제품인 Bright-Glo, Steady-Glo, and Dual-Glo 시약이 개발되었습니다. 이로 인해 microplate를 사용하여 assay를 진행할 수 있게 되었습니다. “Add-and-read” 실험 방법은 샘플 준비를 단순화하고 high-throughput application에 reporter gene assay를 적용할 수 있게 하였습니다.

CellTiter-Glo® Cell Viability Assay

UltraGlo luciferase 개발로 “add-and-read” 방식의 ATP detection assay도 개발되었습니다. ATP는 세포의 상태를 나타내는 중요한 인자로, 이를 측정하는 CellTiter-Glo 는 특히 high-throughput application에서 세포의 생존 (cell viability)를 평가하는 강력한 분석 방법이 되었습니다. 또한 이 분석 원리는 ATP를 측정하는 다른 assay platform, 특히 kinase와 같은 ATPase 활성을 측정하는 Kinase-Glo (2004) 와 ADP-Glo (2009) enzyme assay 개발로 이어지게 됩니다.

Caspase-Glo® 3/7 Assay

Firefly luciferase 반응을 이용하여 샘플 내의 luciferase 혹은 ATP의 양을 측정하는 것 이외에도 기질인 luciferin의 농도 변화 측정이 가능합니다. 각각의 효소에 반응할 수 있는 그룹 (protecting group)을 luciferin에 결합시킨 특정 기질을 사용함으로써, 특정 효소 반응을 민감하게 측정할 수 있는 발광 기법입니다. “Add-and-read”의 간단한 방법으로 측정할 수 있으며 caspase, protease, cytochrome P450 assay가 이런 방법의 assay입니다.

One-Glo™ Luciferase Assay System

프로메가는 firefly luciferase 반응 화학에 대한 더 깊은 이해로 reporter gene assay에 더 적합하도록 향상된 luciferin을 개발하였습니다. 이 새로운 기질인 ‘fluoroluciferin’은 새로운 기질이 개발된 초기 사례입니다.

NanoLuc® Luciferase

유도진화(directed evolution)와 새로운 기질 개발의 경험을 토대로 새로운 luciferase reporter가 디자인되게 됩니다. 심해 새우 유래의 luciferase로부터 개발된 NanoLuc luciferase 는 새롭게 개발된 기질과 반응하여 firefly와 Renilla luciferase보다 100배 높은 감도를 제공하는 19 kDa의 작은 크기의 luciferase입니다. 이런 작고 밝은 특징을 갖는 새로운 luciferase를 활용하여 많은 응용 분야에 사용되고 있으며 새로운 기술 개발의 기초가 되고 있습니다.

NanoBRET™ Technology

NanoLuc luciferase를 개발하려는 노력은 다양한 platform 개발로 이어졌습니다. NanoLuc의 작은 크기와 밝은 발광의 특징은 이상적인 단백질 tag으로 활용 가능하며 BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)의 donor로도 사용이 적합합니다. 또한 donor의 에너지를 흡수하는 acceptor로는 BRET 측정의 제한점을 해결할 수 있는 red spectrum의 ligand가 개발되었습니다. 이러한 형광물질(fluorphore)은 표적 단백질과의 결합을 확인하기 위해 단백질 ligand와 같은 물질로 사용하거나 살아있는 세포에서 단백질-단백질 결합을 확인하기 위해 HaloTag ligand로 활용할 수 있습니다.

NanoBiT® Technology

프로메가는 NanoLuc을 성공적으로 디자인한 이후 NanoLuc luciferase를 활용한 multi-subunit system을 개발하기 위해 노력하였습니다. 그 결과 11개 아미노산의 작은 tag과 큰 subunit인 LgBiT로 구성된 “NanoLuc Binary Technology” 혹은 NanoBiT 시스템이 개발되었습니다. 두 조각의 구조적인 complementation을 통해 NanoBiT luciferase가 만들어지고 이와 기질이 반응하여 밝은 발광이 생성되게 됩니다. LgBiT과의 affinity가 낮은 11개 아미노산의 작은 tag인 SmBiT과 LgBiT을 사용하여 단백질-단백질 결합을 측정할 수 있습니다. 또한 높은 affinity를 가지는 peptide tag인 HiBiT은 LgBiT와 반응하여 self assembly 되기 때문에 endogenous reporter model을 만들 수 있는 CRISPR-based tagging과 같이 사용할 경우 이를 쉽게 확인할 수 있으며 매우 민감한 단백질 tag으로 사용할 수 있습니다.

Lumit™ Technology

NanoBiT technology은 면역 분석(immunoassay)의 component와 SmBiT과 LgBiT conjugation을 통해 다양한 분석 물질 검출에 사용할 수 있는 기술로 발전하게 됩니다. 이렇게 개발된 새로운 “Lumit” technology로 감도 높은 결과 측정과 실험 과정이 보다 간단한 면역 분석(immunoassay)이 가능하게 되었습니다.