생화학 실험에서의 Buffer의 중요성

1966년, Norman Good과 동료들은 생화학 연구 시스템에 적합한 buffer의 조건을 정의하기 위한 연구를 시작하였고 이 연구를 통해 다음과 같은 기준을 제시하였습니다.

• pK_a 6-8. 대부분의 생화학 실험은 pH 6-8에서 최적의 반응을 보입니다. 즉, buffer의 최적 완충 범위는 약산의 해리 상수(pK_a)에서 ±1pH 단위로 정의됩니다.
• 수용성. 대부분의 생물학 반응은 수용액 환경에서 일어납니다. 그러므로 buffer는 물에 잘 용해되어야 합니다.
• Biological membrane에 대한 비투과성. 이 점은 모든 생화학 반응에 중요한 사항은 아닙니다. 그렇지만, biological membrane에 대한 비투과성이 특정 실험의 기준이 된다면 Zwitterionic (분자 내의 각기 다른 원자가 양전하와 음전하를 띰) buffer는 biological membrane을 통과할 수 없다는 것을 기억해두는 것이 좋습니다. Zwitterionic buffer에는 MOPS와 HEPES가 있으며, Tris와 phosphate buffer는 zwitterion으로 isomerization되지 않습니다.
• 최소한의 salt 효과. 다르게 말하자면, buffer 성분은 실험 대상이 되는 생화학적 반응에 관여된 이온들에 영향을 주거나 상호작용해서는 안 됩니다.
• 온도 및 농도의 변화가 해리능에 끼치는 영향이 적을 것. 보통 농도가 변하게 되면 해리에도 약간의 변화가 생기게 됩니다. 이러한 변화가 적다면 stock solution은 pH의 변화 없이 희석될 수 있습니다. 하지만, 어떤 buffer의 경우는 농도의 변화가 해리에 더 큰 영향을 주기 때문에 pH에 상당한 변화를 주지 않고는 stock solution을 희석할 수 없습니다.
  예를 들면, Tris 용액의 pH는 10배 희석할 때마다 pH는 약 0.1씩 감소합니다. 만약 여러분이 working solution을 희석하는데, 그 working solution의 pH가 Tris의 최적 완충 범위 (20℃에서 pH 7.3~9.3)의 경계에 위치한다면, pH는 매우 크게 변할 수 있습니다. (참고로, Tris는 Good이 제시한 좋은 buffer가 아닙니다) 
  온도의 변화도 문제가 될 수 있습니다. Tris는 온도가 변하면 해리에 큰 변화를 보입니다. 예를 들어, 여러분이 4℃에서 Tris buffer, pH 7.0를 만들고 37℃에서 사용한다면, pH는 5.95까지 떨어질 것입니다.
  여러분이 pK_a = 8.3인 Tris buffer을 20℃에서 준비하여 사용한다면, 많은 생화학 반응에서 효과적인 buffer이지만 (pH 7.3-9.3), 같은 buffer를 4℃에서 사용하면 pK_a = 8.8로 변하기 때문에 pH 7.3 조건에서는 좋지 못한 buffer가 됩니다.
  여기서 얻을 수 있는 교훈은, buffer을 만들 때는 사용하려는 온도에서 만들어야 한다는 점입니다. 그리고 만약 여러분의 실험에 온도 변화가 포함되어 있다면, 이에 따른 해리능 변화를 수용할 수 있는 완충 범위의 buffer를 선택하셔야 합니다.
• Buffer의 구성 성분과 중요한 반응 성분 사이의 상호작용의 최소화.  만약 buffer와 중요한 co-factor (아연, 마그네슘과 같은 금속 양이온 등) 사이에서 복합체가 형성된다면, 반응이 저해될 수 있습니다. 예를 들면, 칼슘은 phosphate buffer에서 calcium phosphate로 침전됩니다. 이 경우 Ca²⁺를 필요로 하는 모든 반응이 저해됨은 물론, phosphate buffer 자체의 완충 능력 또한 영향을 받을 수 있습니다.
  효소 반응을 위한 buffer에 과량의 chelating reagent가 포함되어 있는 경우도 문제가 될 수 있습니다 (예. PCR 반응에 고농도의 EDTA가 포함된 경우). Citrate는 칼슘 chelator로, 칼슘 농도가 중요한 실험에서는 citrate buffer를 사용하지 마세요.
  또한 Tris buffer은 반응성 아민(reactive amine)기를 가지고 있기 때문에 문제가 야기될 수 있습니다. 만약 Tris buffer를 RNase-free로 만들려고 한다면, Tris 분자의 아민기가 RNA 실험용 수용액에 처리하는 diethylpyrocarbonate (DEPC)와 반응할 것입니다. 그렇기 때문에 Tris가 들어있는 용액에 DEPC를 처리하지 마세요. HEPES도 DEPC와 반응하는 buffer입니다. (MOPS가 대부분의 RNA 실험에 훨씬 나은 buffer란 점도 기억해 두세요!)
  Take-home message: Buffer는 활성이 없는 물질이 아닙니다. 따라서, 어떤 buffer를 사용할지 결정할 때는 신중히 결정하세요.
• 화학적 안정성. Buffer는 working condition에서 안정적이고, 분해되지 않아야 합니다. 또한 buffer가 사용되는 실험 시스템에 의해 영향을 받거나 산화되어서는 안 됩니다. 목적하는 반응에 반응하는 요소 (예: 대사산물들)를 가진 buffer는 사용하지 마세요.
  MOPS 등의 일부 buffer는 빛으로부터 차단되어야 하지만, 올바르게 보관된다면 생화학 반응 및 RNA 전기영동을 비롯한 다양한 실험에 매우 유용합니다.
• UV의 흡수 최소화. 분광 광도 측정 실험 시, buffer가 판독 범위 파장대의 UV를 흡수해서는 안 됩니다.
• 사용의 편리함. Buffer의 성분들은 구하고 준비하기 쉬워야 합니다.

Buffer는 단순히 실험의 보조물질이 아닙니다. buffer의 특성과 실험 조건을 충분히 고려하여 선택하면 실험의 성공 가능성과 신뢰성을 크게 높일 수 있습니다. 특히 온도, pH, 화학적 상호작용 등의 요인을 신중히 검토하는 것이 중요합니다.

Buufer는 온도와 농도 같은 요인은 pK_a에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에, buffer이 최적의 효능을 갖는 pH 범위에도 큰 영향을 미칩니다. 성공적이고 재현 가능한 실험 결과를 얻기 위해 buffer를 신중히 준비하는 것이 중요합니다.

적절한 온도와 농도로 buffer를 준비하세요.

온도 변화는 해리(dissociation)에 영향을 미치기 때문에, 여러분이 실험을 수행하는 온도에서 buffer을 준비해야 합니다. 만약 여러분의 실험 과정에서 온도가 변한다면, 변화된 온도 변화를 수용할 수 있는 pK_a를 갖는 buffer을 선택하세요.

농도 변화 또한 해리에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 만약 buffer를 stock으로 만들어 보관하여 사용하고자 한다면, stock solution을 원하는 농도로 희석하고 적정 온도로 equilibration 한 후 pH 조정하거나 적어도 희석 후 pH를 다시 확인해야 합니다.

Buffer system의 pH를 알맞게 조정하세요.

많은 buffer의 성분은 산 혹은 염기의 결정(crystalline) 상태 (예. Tris)로 공급됩니다. 이것들을 물에 녹인 수용액의 pH는 pK_a에 근접하기 않기 때문에, 적절한 buffer를 만들기 위해 알맞은 산이나 염기를 사용해 pH를 조정해야 합니다. 만약 결정 상태의 buffer 성분이 산이라면, buffer system에 원하지 않는 counter 이온이 추가되지 않는 염기를 사용하여 pH를 조절할 수 있습니다. 반대로, 결정 상태의 buffer 성분이 염기라면 적절한 산을 사용할 수 있습니다. Note: 결정 상태의 산 혹은 염기를 만들고자 하는 buffer의 최종 부피의 60-70% 증류수에 용해하여 pH 조정에 사용할 산 또는 염기를 추가할 부피를 남겨둡니다. 원하는 pH에 도달하면 물을 추가하여 최종 부피를 맞추면 됩니다.

하지만, 많은 buffer들이 결정 상태의 성분을 물에 녹인 후 pH를 pK_a에 맞게 조절하는 방법으로 만들어지지 않습니다. 대신, 자유산이나 염기(free acid or base)와 salt를 특정 비율로 혼합하여 buffer system의 pH가 원하는 수준이 될 수 있도록 합니다. 예를 들어, 0.1M HEPES 용액과 0.1M HEPES, sodium salt 용액을 섞으면 적정 pH 6.55 - 8.55 범위를 갖는 0.1M HEPES buffer가 준비됩니다. Sodium citrate buffer는 citric acid와 trisodium citrate을 혼합하여 원하는 pH로 조정할 수 있습니다.

다른 buffer들은 Henderson-Hasselbalch 계산식을 이용하여 buffer 성분과 그 짝산 혹은 짝염기를 섞어서 만듭니다. 예를 들어, phosphate buffer는 monobasic과 dibasic sodium phosphate 용액을 특정 비율로 혼합하여 만듭니다. Sodium bicarbonate buffer는 sodium carbonate 용액과 sodium bicarbonate 용액을 혼합하여 만듭니다.

pH meter를 올바르게 관리하고 사용하세요.

pH meter는 사용하기 쉬워 보이지만 적절한 관리가 필요합니다. Electrode는 깨끗하게 유지되어야 하며 electrode solution에 채워져 있어야 합니다. 그리고 calibration buffer는 오염 없이 올바르게 준비되어야 합니다. pH meter의 electrode는 온도에 민감하기 때문에 pH meter를 사용할 때도 온도가 중요합니다. 따라서, pH를 측정하는 동안 pH meter는 주위의 온도(ambient temperature)로 설정되어야 합니다. 유감스럽게도, pH meter는 종종 실험실에서 가장 소외된 장비이곤 합니다. 제조사의 사용 설명서를 pH meter 사용 시 바로 참고할 수 있도록 준비해 두시고, 실험실의 모든 구성원이 meter 사용 방법 및 관리 방법을 이해하고 있는지 확인하세요. 만약 pH meter를 오용하는 경우, 실험실 공용 buffer pH가 부정확할 수 있으며, 그로 인한 결과는 처참할지도 모릅니다.

Buffer 준비를 위한 팁

• 사용하기 전에 보관 중인 모든 buffer를 확인하세요. 만약 buffer가 혼탁하거나 변색되었다면 사용하지 마세요. 이 경우 미생물 오염이 발생했거나, 화학적으로 불안정해졌을 수 있습니다. 한 가지 예외는 MOPS로, 때때로 옅은 노란빛을 띱니다. 오염의 징후를 확인할 때는, 오염 물질이 바닥에 가라앉아 있을 수 있으니 가볍게 병을 휘저어 이를 확인하세요.
• 실험실의 buffer 준비를 위한 가이드라인을 만들 때는 좋은 과학 실험의 여부는 재현 가능함에 달려있고, buffer가 정확하고 일정하게 만들어지지 않으면 실험을 재현할 수 없기 때문에 완벽해야 합니다. 사용된 재료의 등급, 공급처 등의 정보를 포함시키세요. 사용한 산 또는 염기와 권장 농도를 표시하세요. 또한, 만드는 과정에서 pH를 조정하는 시점을 명시하세요. 이 점은 특별히 buffer에 추가 성분을 더해야 한다면 중요합니다.
• 일부 buffer 성분 (예: PIPES)은 쉽게 용해되지 않아, 약염기나 약산, 혹은 가열이 필요할 수 있습니다.
• 일부 buffer 성분 (예: MOPS, HEPES)은 가열하면 분해되기 때문에 고압멸균(autoclave)은 피해야 합니다.
• Tris와 glycine과 같은 1차 아민(primary amine)이 포함된 buffer는 Bradford dye-binding 단백질 분석을 방해합니다 (Stoll and Blanchard, 1990).
• 산과 염기를 다룰 때에는 보호복과 보호안경을 착용하세요. 그리고 강산을 강염기로 중화시키지 마세요. 용액이 담긴 용기를 녹일 만큼의 발열 반응이 일어날 수 있기 때문입니다.
• 만약 어떠한 이유로 물이 아닌 다른 용매를 사용할 경우, 이 용매가 buffer 성분의 Ka에 어떤 영향을 미치는지 알고 있어야 합니다.

Acetic acid을 예로 들자면, 약산, 수소이온, 짝염기 간의 평형 관계를 다음과 같이 수학적으로 나타낼 수 있습니다:

HAc = H⁺ + A^– , 여기서 acetic acid의 해리 속도 상수가 k₁ 이고, acetate과 수소 이온의 결합 속도 상수는 k₂ 입니다. Acetic acid의 해리 속도(–d [HAc]/dt)는 해리 속도 상수와 acetic acid의 농도에 의존적이고, 다음과 같이 나타낼 수 있습니다.

– d [HAc]/dt = k₁ [HAc]

마찬가지로, acetate 이온과 수소 이온이 acetic acid를 형성하기 위한 결합 속도 (d[HAc]/dt)는 결합 속도 상수 (k₂ )와 acetate 이온과 수소 이온 농도에 따라 달라집니다:

d [HAc]/dt = k₂ [H⁺][A^–]

평형 상태에서, 결합 속도와 해리 속도는 동일하므로,

k₁ [HAc]= k₂ [H⁺][A^–] or k₁ /k₂ = [H+][A^–]/[HAc]

여기서 k₁ /k₂ = K_a 평형상수는,

K_a (the equilibrium constant) = [H⁺][A^–]/[HAc]

이 방정식은 수소 이온 농도를 평형 상수와 해리되지 않은 acetic acid 및 acetate 이온으로 나타낼 수 있습니다.

[H⁺] = K_a ([HAc]/A^–])

pH = –log [H⁺] 이고 pK_a 는 –log K_a로 정의되므로, 위의 평형식을 –log로 변환할 수 있습니다:

–log [H⁺] = –log K_a –log ([HAc]/A^–])

pH와 pK_a으로 변환하면,

pH = pK_a –log ([HAc]/A^–])

–log의 부호를 바꾸기 위해, [HAc]/A^–]를 뒤집으면

pH = pK_a + log ([A^–]/[HA])

이렇게 Henderson-Hasselbalch 방정식을 얻을 수 있습니다. 이 방정식을 이용하여 산과 염기의 농도, 그리고 pK_a를 알고 있을 때 pH를 계산할 수 있습니다. 그리고 buffer system의 pK_a는 해당 buffer의 가장 효과적인 pH 범위를 결정합니다.

Bicarbonate-Carbonate buffer (pH 9.2-10.8) 만들기

0.1M bicarbonate buffer 100ml을 만들기 위해, sodium bicarbonate와 sodium carbonate decahydrate를 아래와 같이 섞으세요.

Solution A: 0.1M sodium bicarbonate (NaHCO₃ MW = 84.0) (MW = molecular weight, 분자량)

Solution B: 0.1M sodium carbonate, decahydrate (Na₂CO₃•10H₂O FW = 286.2) (FW = formula weight, 화학식량)

Citrate Buffer (pH 3.0–6.2) 만들기

T0.1M citrate buffer 100ml을 만들기 위해, citric acid monohydrate와 trisodium citrate dehydrate를 아래와 같이 섞으세요.

Solution A: 0.1M citric acid monohydrate (C₆H₈O₇•H₂O FW = 210.14)

Solution B: 0.1M trisodium citrate, dihydrate C₆H₅O₇Na₃•2H₂O FW = 294.12)

Phosphate Buffer (pH 5.8–8.0 at 25°C) 만들기

0.1M phosphate buffer100ml을 만들기 위해, sodium phosphate dibasic dihydrate와 sodium phosphate monobasic monohydrate를 아래와 같이 섞고, 100ml이 되도록 증류수를 채워주세요.

Note: The dibasic stock sodium phosphate may be somewhat harder to dissolve; adding a little heat may help.

Solution A: 0.2M sodium phosphate, dibasic dihydrate (Na₂HPO₄•2H₂O FW = 178.05)

Solution B: 0.2M sodium phosphate, monobasic, monohydrate (NaH₂PO₄•H₂O FW = 138.01)

추가적인 buffer와 용액 조성

1M HEPES (pH 7.5)

• 23.83g HEPES
• 100ml이 되도록 증류수를 넣어주세요.

Potassium hydroxide (KOH)를 이용해 pH 7.5를 맞추고, 4°C에 보관하세요.

5X MOPS buffer

• 0.2M MOPS (pH 7.0)
• 0.05 sodium acetate
• 0.005M EDTA (pH8.0)

2L buffer를 만들기 위해, MOPS 83.72g (free acid) 과 sodium acetate 8.23g을 DEPC-treated water 1.6L에 넣고 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. DEPC-treated 0.5M EDTA 20ml를 추가하고 10N NaOH을 사용하여 pH 7.0으로 맞추세요. DEPC-treated water로 최종 부피를 2L로 맞추고, 여과 멸균한 후 소분하여 보관하세요.

phosphate-buffered saline (PBS)

• 8g NaCl, 0.2g KCl
• 1.44g Na₂HPO₄
• 0.24g KH₂PO₄

위의 성분들을 증류수800ml에 녹이고, HCl를 사용해 pH 7.4로 조정해 주세요. 물을 추가하여 1L를 맞춘 후 소분하여 고압 멸균하세요.

PBS (Mg²⁺- and Ca²⁺-free)

• 137mM NaCl
• 2.7mM KCl
• 4.3mM Na₂HPO₄
• 1.4mM KH₂PO₄

최종 pH는 25°C에서 7.4가 되어야합니다.

PBST (pH 7.4)

• 137mM NaCl
• 2.7mM KCl
• 8.1mM Na₂HPO₄
• 1.47mM KH₂PO₄
• 0.05–1% Tween® 20

50X TAE

Tris base 242g과 Na₂EDTA•(2H₂O) 37.2g을 탈이온수(deionized water) 900ml에 녹여주세요. Glacial acetic acid 57.1ml를 추가한 후, 물을 추가하여 최종 부피를 1L로 맞추세요. 실온이나 4°C에서 보관하세요.

10X TBE

Tris base 108g과 boric acid 55g을 탈이온수 900ml에 녹이세요. 0.5M EDTA (pH 8.0) 40ml를 추가하고, 물로 최종 부피 1L가 될 수 있도록 맞추세요. 실온이나 4°C에서 보관하세요.

TBST

• 20mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 150mM NaCl
• 0.05–0.1% Tween® 20

TE buffer

• 10mM Tris-HCl (pH 8.0)
• 1mM EDTA

TEN buffer

• 40mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 1mM EDTA (pH 8.0)
• 150mM NaCl