Subcloning 가이드

DNA Agarose gel 전기영동

제한효소 반응 후 선형이 된 plasmid DNA와 같은 선형의 dsDNA를 agarose gel을 이용하여 running하는 것은 분자생물학 실험실에서의 일상입니다. 기본적 실험 방법은 매우 간단합니다.

1. 전기영동 장치를 제조사의 instruction에 따라 세팅합니다.
2. 필요한 양의 agarose를 측정하여 적정량의 TAE 또는 TBE 1X buffer가 있는 플라스크 (또는 병)에 넣습니다. 예를 들어, 1%의 agarose gel을 준비하기 위해 100ml buffer에 agarose 1.0g를 첨가하십시오. Note: Buffer와 agarose의 부피는 용기 부피의 절반을 초과해서는 않도록 하세요.
3. 모든 agarose가 녹는데 필요한 최소 시간 동안 buffer-agarose 혼합물을 전자레인지나 핫 플레이트에서 가열합니다. 일정한 시간 간격으로 가열을 중단하고 용기를 휘저어 내용물을 섞어줍니다. 이 때, 용액이 끓어 넘치지 않도록 하십시오.
   CAUTION: 플라스크와 내부의 혼합물은 매우 뜨겁습니다! 휘젓는 것 또한 용액을 강하게 끓게 할 수 있습니다. 따라서 적절한 예방 조치를 취해야 합니다.
4. 용액을 50~60°C까지 식힌 후 gel을 캐스트에 붓습니다. 그리고 겔이 완전히 굳도록 그래도 두세요. (대개, 실온에서 30분이면 충분합니다). Gel에서 comb을 제거한 후, 전기영동 챔버에 넣고 TAE 또는 TBE 1X buffer를 충분히 넣어 gel 표면을 덮습니다.
5. DNA샘플과 1X Blue/Orange Loading Dye를 잘 섞고 well에 로딩합니다.
6. 전기영동 장치를 전원 공급 장치에 연결하고 gel에 적절한 전압이 걸리도록 합니다. 2kb보다 큰 DNA 조각의 표준 gel 전기영동은 일반적으로 5~8V/cm의 전압이 필요합니다. 더 높은 전압과 짧은 running time은 gel의 resolution을 감소시키고 과열을 유발하여 agarose를 녹일 수 있습니다.
7. 전기영동이 완료되면 staining을 위해 gel을 옮깁니다. 상온에서 0.5μg/ml ethidium bromide용액에 30분 동안 담그거나, gel을 만들 때 사용한 동일한 buffer에 1:10,000으로 희석한 Diamond Nucleic Acid Dye 용액에 담근 채로 빛을 차단시키고 15-30분동안 염색합니다. Note: ethidium bromide 또는 Diamond Nucleic Acid Dye는 staining을 위해 gel을 만들 때, 또는 전기영동 buffer에 동일한 농도로 넣어 사용할 수 있습니다. 그러나 이런 방법은 전기영동 후 staining을 따로 할 필요가 없지만, DNA 조각의 정확한 크기 결정에 방해가 될 수 있습니다. CAUTION: ethidium bromide을 다룰 때는 항상 장갑을 착용하십시오.
8. UV lightbox나 다른 gel documentation system 또는 Diamond Nuclear Acid Dye를 사용하는 경우라면 blue light transilluminator 위에 gel을 놓습니다. 카메라의 권장 사양에 따라 gel 사진을 찍습니다. Diamond Nuclear Acid Dye는 SYBR® Gold 필터가 있거나 설정이 되는 모든 시스템에서 시각화 및 사진 촬영이 가능합니다. Caution: 자외선 광원으로 작업할 때는 보호 안경을 착용하세요.
   Note: ethidium bromide를 사용하는 경우, 자외선 박스에서 gel을 확인하기 전에 깨끗한 1X running buffer에서 gel을 헹구거나 destaining해야 할 수도 있습니다.
   

용액의 조성

Agarose gel을 포함하여 gel running에 필요한 거의 대부분의 시약들은 premade 상태로 구입할 수 있습니다. 만약 시약을 직접 준비하려면 다음의 방법과 같이 만드세요.

Blue/Orange Loading Dye, 6X (Cat.# G1881)
10mM Tris-HCl, pH 7.5
50mM EDTA
15% Ficoll® 400
0.03% bromophenol blue
0.03% xylene cyanol FF
0.4% orange G(다른 dye를 사용하여 custom loading dye를 만들 수 있음)

TAE 50X Buffer (1L) (Promega 10X, 40X buffer 사용 가능함 [Cat. # V4271, V4281]: Tris base 242g와 disodium EDTA dihydrate 37.2g를 DW (deionized water) 900ml에 녹입니다. 여기에 Glacial acetic acid 57.1ml를 넣고 물을 부어 최종 부피를 1L로 맞춥니다. 실온 또는 4°C에서 보관하십시오.

TBE 10X Buffer (1L) ) (Promega 10X buffer 사용 가능함 [Cat. # V4251]): Tris base 108 g과 boric acid 55 g을 DW 900 ml에 녹입니다. 0.5M EDTA(pH 8.0) 40ml를 넣고 최종 부피를 1L로 맞춥니다. 실온 또는 4°C에서 보관하십시오.

많은 연구자들은 PCR 산물을 plasmid 클로닝 vector로 subcloning하고자 합니다. PCR 기술의 초창기에 연구자들은 blunt-end ligation방법으로 blunt-end vector에 PCR product를 subcloning하기가 쉽지 않다는 것을 깨달았습니다. 과제 중 일부는 Taq DNA 중합효소와 같은 내열성 DNA 중합효소가 template 독립적으로 blunt DNA의 3' 말단에 단일 뉴클레오타이드 염기를 추가하는 것입니다(Clark, 1988. Mole et al, 1989). 이러한 어려움을 야기하는 원인 중 하나가 Taq DNA polymerase와 같은 thermostable polymerase가 template의 존재와 무관하게 blunt-end DNA의 3’말단에 단일 뉴클레오타이드를 추가한다는 사실이었습니다(Clark, 1988. Mole et al, 1989). 이러한 polymerase는 대게 아데닌을 붙여 PCR 산물에 “A overhang”을 남깁니다.

역사적으로, 연구자들은 PCR 산물의 A overhang으로 인한 클로닝의 어려움을 극복하기 위해 여러가지 방법을 시도해 왔습니다. 한 가지 방법은 E. coli DNA Polymerase I의 Klenow fragment를 PCR 산물에 처리하여 subcloning을 하기 위한 blunt-end DNA 절편을 생성하는 것입니다. 그러나 이 방법은 PCR fragment에는 효과적이지 않습니다.
연구자들이 일반적으로 사용하는 또 다른 방법은 PCR primer(Sharf et al, 1986) 끝에 제한효소 사이트를 추가하여 PCR fragment에 제한효소 사이트가 포함되도록 하는 것입니다. 그런 다음 PCR 산물을 digestion하여 원하는 plasmid 클로닝 vector에 바람직한 방향으로 subcloning할 수 있습니다. 모든 제한효소가 DNA의 말단 부위에서 효율적으로 작용하는 것이 아니기 때문에 사용하고자 하는 모든 제한효소를 사용하지 못할 수 있습니다. 따라서 이 방법을 사용할 때는 primer 설계에 주의해야 합니다(Kaufman and Evans, 1990). 어떤 제한효소는 인식 사이트의 바깥부분에 여분의 염기가 필요하므로 PCR primer를 만드는데 추가 비용이 발생할 뿐 만 아니라, 게놈에 존재하는 관련 없는 서열이 priming될 위험이 있습니다.

PCR 산물을 클로닝하는 가장 일반적인 방법은 T-Vector 클로닝입니다. 기본적으로, plasmid 클로닝 vector는 PCR amplicon의 3'A overhang과 매칭이 되도록 3'T overhang을 포함하는 형태로 만들어집니다(Mezei and Storts, 1989). 따라서 A-tailed amplicon은 T4 DNA ligase 외의 추가적인 효소처리없이 T-tailed plasmid vector에 직접 ligation됩니다. Promega는 routine subcloning과 direct mammalian expression이 가능한 T-tailed plasmid vector기반 시스템을 보유하고 있습니다.

*모든 염기들이 3´ overhang에 위치할 수 있으며, 아데닌이 거의 대부분을 차지합니다.

T-Vector 시스템: pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vectors

PCR subcloning에서 가장 기본적으로 요구되는 것은 단순하고 일반적인 클로닝 vector입니다. pGEM®-T과 pGEM®-T Easy Vector System은 이러한 목적으로 설계되었습니다. 이 vector에는 T7 promoter와 SP6 promoter가 존재하여 시퀀싱할 때 사용할 수 있는 primer가 결합할 수 있고, 적절한 RNA polymerase를 사용하여 insert DNA를 어느 방향으로든지 in vitro transcription할 수 있습니다. 또한 LacZα 유전자가 포함되어 있기 때문에, 적절한 박테리아 균주(예: JM109, DH5α™, XL1 Blue 등)를 이용하여 쉽게 blue/white screening을 통해 재조합 plasmid DNA (recombinant DNA)가 포함된 colony를 선별할 수 있습니다. pGEM®-T Vectors는 2X Rapid Ligation Buffer와 함께 제공되며, 함께 공급된 T4 DNA Ligase와 단 1시간만에 효율적인 ligation이 가능합니다. 실험자들이 직접 E. coli 세포를 준비하거나 Promega의 JM109 Competent Cells을 구입할 수 있습니다. Subcloning의 효율을 극대화하기 위해서 subcloning 전에 PCR 산물을 정제하십시오. PCR primer와 primer dimer가 subcloning 효율을 감소시킬 수 있기 때문입니다.

PCR 클로닝 Controls

모든 Promega PCR 클로닝 시스템은 control insert가 함께 제공됩니다. 이 positive control을 사용하여 ligation과 transformation을 함으로써, 타겟 insert의 ligation과 transformation에 대한 많은 정보를 확인할 수 있습니다. Promega의 positive control을 이용한 것과 no-insert control의 blue colony의 수는 대략적으로 비슷해야 합니다. Negative control 중 일부는 white colony로 나타낼 수 있습니다.

T-Cloning 실험의 결과 해석

Experimental insert 효율이 control insert과 비슷한 white colony %를 보일 경우: 실험이 성공적으로 수행된 것입니다. White colony의 80% 이상이 타겟 insert를 포함하고 있을 것입니다.

Experimental insert와 control insert의 결과가 negative control과 유사할 경우: Ligation 실패입니다. Ligation buffer가 freeze/thaw를 여러 번 반복하지 마십시오. Ligase buffer는 ATP를 함유하고 있으며 freeze/thaw cycle에 의해 손상될 수 있습니다. 실험적인 필요에 따라 ligase buffer를 적은 볼륨으로 aliquot하여 사용하십시오.

Experimental insert, control insert, negative control 모두 colony가 없는 경우: Transformation 실패입니다. 사용한 competent cell이 이상이 없는지, supercoiled plasmid를 사용했는지를 체크하고, transformation 효율을 확인하십시오. 1 × 108 cfu/μg 이상의 transformation 효율을 나타내는 competent cell을 사용하여 positive control insert ligation에서 100개 이상의 colony를 확보해야 합니다.

Experimental insert는 control insert 또는 negative control(no-insert)보다 더 많은 blue colony를, control insert 보다 더 적은 white colony를 갖습니다(In-frame insertion, no interruption of α-fragment).
pGEM®-T Vector Control DNA는 재조합 plasmid가 되었을 때 lacZ reading frame을 방해하기 때문에 white colony를 생성합니다. 그리고 LacZ reading frame을 방해하는 다른 DNA 단편이 성공적으로 삽입되었을 때도 white colony가 형성됩니다. 가끔 성공적으로 insert가 삽입이 되더라도 lacZ reading frame이 방해되지 않아 blue colony가 만들어질 수 있습니다. 이러한 현상은 500bp 이하의 PCR 산물을 사용할 때 가장 많이 발생하는 경향이 있지만, 최대 2kb의 insert를 사용할 때도 blue colony가 만들어지기도 합니다. 게다가, 어떤 insert DNA의 경우 연한 blue colony를 형성하기도 하고, colony의 중앙은 푸른색인데 둘레는 흰색인 “bullseye” colony를 만들기도 합니다. 이런 경우도 역시 성공적인 insertion입니다.

제한효소 사이트를 포함하는 PCR Primer를 사용한 Subcloning

원하는 insert DNA의 말단에 적절한 제한효소 사이트가 없을 수도 있습니다. 이는 PCR을 사용하여 적절한 위치에 제한효소 사이트를 생성함으로써 해결할 수 있습니다. 이 방법을 사용하기 위해, 제한효소 사이트는 PCR primer의 5' 말단에 위치하도록 설계합니다. 특정 제한효소는 DNA 조각의 끝에 위치한 인식 서열을 효과적으로 절단하지 못하므로 제한효소 인식 사이트 앞에 최소 4개의 염기를 추가로 포함하는 것이 바람직합니다. 이렇게 하는 것은 대부분의 제한효소에 효율적인 절단 결과를 가져다 줄 것입니다.

PCR 산물을 digestion할 때의 성공 여부는 PCR 산물의 순도에 따라 결정됩니다. 원하는 PCR 산물과 비교해 보면 primer와 primer dimer가 압도적으로 많이 존재하는 경우 PCR 산물은 제한효소를 두고 primer, 그리고 primer dimer와 경쟁하게 되고, 결과적으로 PCR 산물의 일부만 제한효소에 의해 digestion 됩니다. PCR을 수행한 후 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System으로 간단하게 정제하면 제한효소 절단 효율을 개선시킬 수 있습니다.

PCR 산물이 subcloning되지 않는 상황이 발생한다면, 이는 PCR 산물 끝에 근접한 인식 사이트에 의해 digestion이 잘 되지 않음으로 결과에 영향을 미친 것일 수 있습니다. pGEM®-T Easy Vector에는 제한효소 사이트가 적절히 배치되어 있어, PCR 산물 subcloning을 효율적으로 수행할 수 있습니다.

E. coli Subcloning 균주의 특성

JM109, DH5α™, XL-1 Blue와 같은 일반적으로 실험실에서 사용하는 균주는 wildtype E.coli와는 다릅니다. 이 균주들은 plasmid의 propagation을 촉진하기 위한 몇 가지 돌연변이를 가지고 있습니다. 일반적으로, 실험실에서 사용하는 균주는 재조합에 관여하는 유전자인 recA 유전자(recA1)에 돌연변이를 가지고 있습니다. 이러한 돌연변이는 E.coli genome과 plasmid DNA가 재조합되는 것을 제한하기 때문에, E.coli에 삽입된 plasmid가 안정적으로 존재할 수 있게 합니다(recA1 돌연변이가 recA13 돌연변이보다 더 효과적입니다). 이들 균주는 또한 정제 과정에서 plasmid와 함께 정제될 수 있는 핵산분해효소를 불활성화시키는 endA1돌연변이를 가지고 있습니다. 이러한 돌연변이는 더 높은 품질의 plasmid를 정제할 수 있게 해 줍니다. 이러한 돌연변이가 없는 균주(예: RR1, HB101 등)로부터 plasmid를 추출할 때는 특별한 처리(예: Alkaline Protease digestion)를 함으로써 핵산분해효소를 제거해야 합니다.

일반적으로 실험실에서 사용하는 균주는 제한효소와 methylase 기능을 하는 EcoKI 혹은 EcoBI의 존재에 따라 K strain, B strain으로 명명합니다. Wildtye K strain E.coli는 외래 DNA를 절단하는 EcoKI 제한효소와 host의 DNA 인식 서열을 마스킹하여 보호하는 EcoKI methylase, 둘 다 가지고 있습니다. B strain의 EcoBI 제한효소와 methylase도 동일한 목적을 수행합니다. JM109, DH5α™, XL-1 Blue와 같은 균주는 K strain이지만 hsdR17(rK–, mK+) 돌연변이를 가지고 있습니다. 이 돌연변이의 EcoKI 제한효소는 knock-out되어있지만 methylase는 손상되지 않았습니다. 따라서, 이러한 균주는 B 혹은 K strain으로부터 분리된 plasmid DNA를 분해하지는 않지만 methylation할 수 있습니다. 이러한 돌연변이는 DNA를 온전한 K 제한효소와 methylase기능을 하는 K strain으로 옮겨야 할 때 유용하게 사용됩니다.

Subcloning할 때, blue/white screening을 수행하고자 한다면 lacZ∆ 유전자를 갖고 있는 E.coli를 이용하여 transformation을 해야 합니다. 이 돌연변이는 β-galactosidase 유전자의 일부가 삭제되고 ω-fragment를 남긴 돌연변이입니다. Plasmid vector는 이 삭제된 부분 (α-fragment)을 제공합니다. 박테리아 안에서 plasmid가 α-fragment를 생성하고 E.coli가 ω-fragment를 생성하면, 이것들은 함께 결합하여 기능적인 β-galactosidase를 형성합니다. 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside (X-gal)가 함유된 plate에서 이 박테리아를 배양하면, β-galactosidase 활성의 결과로 colony가 파란색으로 변하고, 이것은plasmid에 의하여 박테리아의 lacZ∆ 유전자가 보완되었음(complementation)을 의미합니다. 이를 α-complementation이라고 합니다. Blue/white cloning 방법은 α-fragment의 암호화 서열 내에 MCS를 갖는 plasmid를 사용합니다. Insert로 인하여 α-fragment의 reading frame이 망가지면 α-complementation를 할 수 없는 non-functional α-fragment이 생성됩니다. 이렇게 α-fragment가 손상된 plasmid의 colony는 insert가 들어가지 않은 plasmid와 색으로 구분됩니다(white vs. blue). 그래서 이것을 blue/white selection이라고 합니다. JM109, DH5α™, XL-1 Blue와 같은 strain은 필수적으로 이 삭제 유전자가 있습니다. 한 가지 차이점은 박테리아의 ω-fragment 생성 방법입니다. JM109와 XL-1 Blue는 lacIq라고 불리는 두 번째 돌연변이를 가지고 있습니다. 이 돌연변이는 lac 오페론의 기질(lactose)이 존재하는 한, lac 오페론으로부터의 전사를 멈추는 LacI repressor의 생산을 증가시킵니다. 이러한 억제를 완화하기 위해, 이 균주들은 잘리지 않는 lactose 유사체인 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 포함하는 배지에서 배양시킵니다. DH5α™는 lacIq 돌연변이를 가지고 있지 않으며, lac오페론의 약한 전사를 통해 지속적으로 낮은 수준의 ω-fragment를 생성합니다. 따라서 blue/white selection을 하기 위한 IPTG가 필요하지 않습니다.

Competent Cell 만들기

Competent Cell 준비: Modified RbCl 방법

이 rubidium chloride(RbCl) 프로토콜은 대부분의 균주에서 CaCl2를 사용한 방법보다 더 높은 transformation 효율을 제공합니다. 여기에서 소개하는 방법은 Hanahan, D.의 논문에서 설명된 과정을 변경한 것입니다(1985): DNA Cloning, Volume 1, D. Glover, ed., IRL Press, Ltd., London, 109.

준비물

• LB medium and plates
• LB + 20mM MgSO₄
• TFB1, ice-cold
• TFB2, ice-cold
• dry ice/isopropanol bath or liquid nitrogen

1. LB plate에서 single colony를 2.5ml의 LB배지가 들어 있는 튜브에 접종합니다. JM109 경우, F´ episome이 유지되도록 M9 + B1 plate를 사용합니다. 37°C shaking incubator에서 overnight 배양합니다(약 225rpm).
2. overnight 배양한 세포를 1:100으로 희석하여 subculture합니다. 20 mM MgSO4가 첨가된 LB 250 ml이 들어있는 1 L 플라스크에 overnight 배양액 2.5 ml를 접종합니다. OD600이 0.4–0.6이 될 때까지 37°C에서 세포를 배양시킵니다(보통 5–6시간 배양하며, 배양시간은 차이가 있을 수 있습니다).
3. 4°C, 4,500 × g force로 5분간 원심 분리하여 세포를 모아줍니다. 250ml 배양을 하였다면, 대형 rotor와 두 개의 250ml 원심분리기 bottle을 사용합니다. 배양액의 절반은 한 bottle에, 나머지 절반은 다른 bottle에 담습니다. Bottle의 균형 맞추는 것을 잊지 마십시오.
4. 배양액의 X0.4 부피의 ice-cold TFB1를 이용하여 세포 pellet을 부드럽게 풀어줍니다. 250ml subculture의 경우, TFB1 총 100ml (50ml/centrifugation bottle)를 사용하십시오. 잘 풀어준 세포를 한 bottle에 모읍니다. 세포를 ice에 보관하고 모든 파이펫, 튜브, 그리고 플라스크를 냉각시킵니다.
5. 4°C에서 잘 풀어준 세포를 얼음에 둔 채 5분간 incubation합니다.
6. 4°C, 4,500 × g force로 5분간 원심 분리하여 세포를 모읍니다.
7. 배양액의 X1/25 부피의 ice-cold TFB1를 이용하여 세포를 부드럽게 다시 풀어줍니다. 250ml subculture의 경우, TFB2 10ml를 사용합니다.
8. 얼음에서 15~60분 동안 세포를 incubation한 후, 100 μl/tube로 분주하여 –70°C에서 보관합니다. 분주하는 동안 세포를 최대한 차갑게 유지하십시오. 튜브를 드라이아이스/이소프로판올 bath 또는 액체 질소에 급속 동결시키고 -70°C에서 보관합니다. 이 방법으로 제조된 JM109 cell은 해동되지 않을 경우 1년간 안정적입니다.

Note: Competent cell은 ice bath rack이나 ChillBlock™을 사용하여 편리하게 급속 냉각할 수 있습니다. Ice bath와 ethanol bath를 준비하십시오. 각 튜브 뚜껑에 라벨을 붙입니다. 라벨이 부착된 튜브의 뚜껑을 연 채, ice bath의 rack에 꽂습니다. 튜브당 100µl 세포를 분주한 다음 튜브의 뚜껑을 닫습니다. 그리고 ethanol bath에 드라이아이스를 넣고 거품이 멈추면, rack과 튜브를 드라이아이스 수조에 옮겨 약 15초간 둡니다. 드라이아이스를 사용할 수 없을 때에는 ethanol bath에 일반 얼음을 사용할 수 있지만 급속 냉동은 되지 않습니다. 튜브를 보관함에 넣고 –70°C freezer에 보관합니다. 튜브와 뚜껑이 맞닿는 부분에 알코올이 묻지 않도록 하세요. 액체 질소도 급속 냉동에 사용할 수 있지만 사용 중인 rack과 호환되는지 확인하십시오. 액체 질소를 위해 디자인된 플라스틱 제품만 사용해야 합니다.

Note: 알코올이 라벨에 묻지 않도록 주의하십시오. 알코올은 라벨을 지울 수 있기 때문입니다.

많은 E.Coli 균주는 episome(예: F'와 P2)을 가지고 있어서 subcloning에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, XL1-Blue와 JM109 strain은 F’ episome에 lacIq∆M15 변이를 가지고 있습니다. Episome은 selection marker 유전자를 포함하여, host의 염색체 밖에서(exrrachromomsomal) 별도로 복제될 수 있는 plasmid입니다. Episome이 있는 strain으로 competent cell을 만들 때, 박테리아는 먼저 선별 배지(selective media)에 도말되어야 합니다. XL1-Blue의 경우, episome에 tetR유전자가 포함되어 있기 때문에, tetracycline이 들어있는 배지를 이용하여 colony를 선별할 수 있습니다. 이것은 이 strain에서 selection marker인 tetR을 갖는 plasmid를 subcloning하여 colony selectin을 할 수 없음을 의미합니다. JM109 세포는 티아민(비타민 B1)이 포함된 M9 최소 배지에서 먼저 선별되어야 합니다. 박테리아의 염색체는 단백질을 합성하는 유전자(proAB)가 결여되어 있지만, episome은 그 유전자를 가지고 있습니다. 따라서, M9 + B1 plate(프로토콜 48페이지)에서 배양된 colony는 blue/white selection이 가능한 competent cell가 될 수 있습니다.

Competent Cell의 transformation 효율 결정하기

이 프로토콜은 위의 competent cell 만드는 프로토콜과 함께 사용할 수 있는 일반적인 프로토콜입니다. Competent cell을 구매하여 사용한다면, 제조사의 instruction을 따르세요. Ligation반응으로 얻어진10ng이상의 DNA를 transformation하면 실제 transformation 효율이 감소할 수 있다는 것을 기억하세요.

1. 100µl로 소분된 competent cell을 ice에서 해동합니다.
2. 100µl 세포를 미리 ice에서 차갑게 해 둔17 × 100mm 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다.
3. Supercoiled plasmid [예. pGEM®-3Zf(+) Vector] 0.1ng를 competent cell 10 µl에 추가하고, 파이펫 팁으로 휘저어 부드럽게 혼합합니다. (파이펫팅으로 섞지 마세요)
4. ice 위의 튜브를 42°C water bath로 옮겨서 45-60초 동안 heat shock을 가합니다. 그 후, 튜브를 즉시 ice에서 최소 2분동안 식힙니다.
5. SOC media 890µl를 튜브에 추가하고(0.1ng DNA/ml 농도), 37°C의 shaking incubator 45분간 incubation합니다. (~150rpm)
6. 900µl SOC media를100µl 세포에 넣어 희석합니다(0.1ng DNA/ml 농도). 그리고 적절한 항생제가 포함된 LB plate에 희석된 세포 100µl을 도말합니다. Transformation 효율을 확인하기 위해서, 희석하지 않은 세포를 도말할 수 있습니다.
7. Plate를 37°C incubator에서 overnight으로 incubation하고 생성된 colony의 수를 계산합니다.

Ligation 반응 생산물로 Transformation하기

이 프로토콜은 위의 competent cell을 만드는 프로토콜과 함께 사용할 수 있는 일반적인 프로토콜입니다. Competent cell을 구입하여 사용한다면, 제조사의 instruction을 따르세요.

1. 소분된 competent cell 100µl을 ice에서 해동합니다.
2. competent cell 100µl을 미리 ice에서 차갑게 해 둔 17 × 100mm 폴리프로필렌 튜브에 옮깁니다.
3. 반응 생성물은 최대 10µl에 10ng이상의 DNA가 사용되지 않도록 하여 competent cell에 추가합니다. 그리고, 파이펫 팁을 이용하여 부드럽게 휘저어 잘 섞습니다(파이펫팅으로 섞지 마세요). 그 상태로 30분동안 incubation합니다.
4. ice 위의 튜브를 42°C water bath로 옮겨 45-60초동안 heat shock을 가합니다. 그리고 곧 바로, ice에서 2분 동안 식힙니다.
5. LB media 또는 SOC media 1ml을 튜브에 추가한 후, 37°C shaking incubator에서 incubation합니다(~150rpm).
6. Transformation mix, 혹은 희석한 mix 100-200µl를 selection plate에 도말합니다. 만약 ligation효율이 낮을 것으로 생각된다면, 10-20초의 quick spin을 통하여 남은 세포의 pellet을 만듭니다. 그리고 media는 버린 후 SOC media 200µl을 추가하여 pellet을 잘 풀어준 후에 plate에 도말합니다.

200cfu = 2 × 10⁵cfu/ng = 2 × 10⁸cfu/µg DNA

Transformation Controls

Control은 subcloning과정에서 문제가 발생한 부분을 파악하는 데 도움이 됩니다. 그리고 subcloning하는 DNA로 박테리아 transformation할 때, transformation 효율도 결정해야 합니다. Insert 없이 잘린 vector, 혹은 탈인산화된 vector인 ligation control을transformation한 것은 실제로 vector와 insert의 ligation한 것의 background colony가 어느 정도인지 예상할 수 있게 합니다.

이제 DNA를 transformation하고 colony가 밤새 자라도록 하였으니 원하는 insert가 포함되어 있는지를 확인해야 합니다. Colony PCR을 하거나, 더 전통적인 방법으로 miniprep후 plasmid를 제한효소로 잘라서 스크리닝할 수 있습니다. Colony PCR은 가장 빨리 수행할 수 있는 초기 스크리닝 방법입니다. 그에 비해, plasmid miniprep은 세포를 키우기 위해 하루가 더 걸리지만 추가 분석을 위한 많은 자료를 제공합니다. 연구자 중 일부는 두 가지 모두 수행하는 것을 선택하지만, colony PCR을 통해 insert를 포함하는 것으로 식별된 colony만을 대상으로 miniprep을 수행합니다.

Colony PCR

Colony PCR은 박테리아를 lysis하고 plasmid의 일부를 증폭하는 과정을 포함합니다. 여러분의 subcloning scheme이 insert 방향을 유지하지 못하는 경우, colony PCR을 이용하여 방향을 스크리닝할 수도 있습니다. Insert 또는 vector 서열에 특이적 primer를 사용하여 재조합 plasmid를 스크리닝할 수 있습니다. 간단하게 vector 특이적 primer와 insert 특이적 primer를 함께 사용하면 됩니다.

Taq DNA polymerase에 의해 남겨진 A-overhang과 T-tailed vector (예: pGEM®-T Easy Vector)를 사용한 PCR cloning은 insert의 방향을 유지하는 기술이 아닙니다. Insert 삽입 방향은 vector 특이적 primer와 insert 특이적 primer를 사용한 colony PCR로 빠르게 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 이 기술은 pGEM-T Easy Vector에 삽입된 1.8kb insert의 방향을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. Colony PCR은 T7 promoter primer와 insert 특이적 정방향 또는 역방향의 PCR primer를 이용하여 수행되었습니다. 이 실험을 위해, cloning 후 8개의 white colony를 선택하여 분석하였습니다. 아래의 그림과 같이 T7 orientation 클론은 T7 primer와 역방향 PCR primer를 사용하였을 때에만 DNA 절편을 생성할 수 있고, 반대 방향인 SP6 orientation 클론은 정방향 PCR primer를 사용할 때만 DNA절편을 생성합니다.

Colony PCR을 위한 Colony Prep

1. 분리가 잘 된 colony를 선택하여 50µl 멸균수에 옮깁니다. 원한다면, 해당 colony 일부는 miniprep을 하기 위해 적절한 항생제가 포함된 LB media로 옮겨 overnight 배양을 할 수 있습니다.
2. 멸균수에 포함된 colony를 10분 동안 끓입니다.
3. 16,000 x g force로 5분 동안 원심분리합니다.
4. 50µl PCR에 5µl의 상층액을 사용합니다.

Plasmid miniprep후 제한효소 digestion를 통한 스크리닝

Colony 스크리닝을 위해 전통적으로 사용하는 방법은 plasmid miniprep후 제한효소 digestion을 수행하는 것입니다. 분리가 잘 되어있는 colony를 선택하여, 적합한 항생제(selection marker)가 포함된 culture media에 옮깁니다. 이 때, 적절한 멸균이 중요합니다. 그리고 다양한 조성의 culture media가 일반적으로 miniprep을 하기 위해 사용됩니다. Promega는miniprep을 위한 배양을 위해 항생제가 포함된 LB media를 권장합니다. Terrific Broth와 같은 rich media를 사용하면 박테리아가 매우 높은 밀도로 성장하여 항생제를 고갈시킬 수 있습니다. 항생제가 고갈되면 plasmid를 유지하기 위한 selection pressure가 사라져 박테리아가 plasmid를 잃어버릴 수 있습니다.

배지 1-10ml에 colony접종이 가능합니다. High-copy plasmid의 경우, 1–5ml(일반적으로 1–2ml)이면 충분합니다. Low-copy plasmid라면, 10ml에 접종하세요. Media에 적절한 양의 공기가 들어가는 것(aeration)도 최대한 높은 밀도의 세포를 생산하는 데 매우 중요합니다. 17 × 100mm 배양 튜브는 1-2ml이 적합합니다. 더 많은 양을 배양하기 위해선 50ml 멸균 일회용 배양 튜브가 더 좋습니다. Shaking (~250rpm)하면서 overnight(12-16시간) 배양합니다. 공기와 맞닿는 표면적이 넓을수록 aeration도 더 잘됩니다. 멸균된 25–50ml 삼각 플라스크에서 miniprep을 위한 배양물을 키울 수도 있습니다.

DNA가 정제되면, plasmid 일부는 제한효소 digestion으로 스크리닝합니다. High-copy plasmid의 경우, 1-5ml에서 추출 및 정제하여 4–10µg의 plasmid DNA를 얻을 수 있습니다. Low-copy plasmid의 경우, 10ml 정제 당 1–3µg의 plasmid DNA를 얻을 수 있습니다. 제한효소 반응에 0.5-1µg의 plasmid를 사용하십시오. 그리고 plasmid에 insert가 포함되어 있는지 쉽게 결정할 수 있도록 제한효소 반응을 디자인하십시오.
Note: 잘리지 않은 plasmid를 동일한 gel에 loading하여 비교할 수 있습니다.

1. Clark, J.M. (1988) Novel non-template nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucl. Acids Res. 16, 9677–86.
2. Higgins, N.P. and Cozzarelli, R. (1989) In: Recombinan DNA Methodology  Wu, R., Grossman, L. and Moldave, K., (Eds). Academic Press, Inc., San Diego, California.
3. Kaufman, D.L. and Evans, G.A. (1990) Restriction endonuclease cleavage at the termini of PCR products. BioTechniques 9, 304–6.
4. Mezei, L.M. and Storts, D.R. (1994) Cloning PCR Products. In: PCR Technology Current Innovations. Griffin, H.G. and Griffin, A.M. (eds). CRC Press, 21–7.
5. Mole, S.E., Iggo, R.D. and Lane, D.P. (1989) Using the polymerase chain reaction to modify expression plasmids for epitope mapping. Nucl. Acids Res. 17, 3319.
6. Okazaki, R. et al. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59, 598.
7. Scharf, S.J., Horn, G.T. and Erlich, H.A. (1986) Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science 233, 1076–8.