단백질 정제 방법

단백질은 세포가 구조와 기능적으로 온전함을 유지하게 하는 생물학적 거대분자이며, 다수의 질병이 단백질 기능 이상(protein malfunction)과 관련됩니다. 단백질 정제는 개별 단백질 및 단백질 complex를 분석하고 다른 단백질, DNA 또는 RNA와의 interaction을 확인하기 위한 기본 단계입니다. 원하는 사이즈, throughput, downstream application에 따른 다양한 단백질 정제 전략이 존재합니다. 최적의 접근법은 경험적으로 결정해야 하는 경우가 많습니다.

단백질 정제

가장 적합한 단백질 정제 프로토콜은 정제하는 단백질뿐 만 아니라 재조합 단백질을 발현하는 데 사용되는 세포(예. 원핵세포 vs. 진핵세포) 등 다른 여러 가지 요소에 의해서 결정됩니다. 사용 편의성, 세포의 빠른 성장 속도, 낮은 배양 비용으로 인해 재조합 단백질을 생산하는 많은 연구자들은 여전히 Escherichia coli를 첫 번째 옵션으로 선택하고 있습니다. E. coli에서 발현된 단백질은 비교적 많은 양을 정제할 수 있지만, 이러한 단백질(특히 진핵생물의 단백질)은 적절한 단백질 활성이나 folding이 나타나지 않을 수 있습니다. 배양된 mammalian 세포는 적절한 post-translational modification을 통해 올바르게 folding 되고 기능적 성질을 지닌 mammalian 단백질을 생산하는 데 있어 더 나은 선택지가 될 수 있습니다(Geisse et al. 1996). 그러나 배양된 mammalian 세포의 재조합 단백질의 발현율이 낮기 때문에 정제에 어려움이 있습니다. 따라서 만족스러운 수율(yield)과 순도(purity)를 얻으려면 정제되지 않은 cell lysate로부터 관심 단백질을 매우 선택적이고 효율적으로 capture 해야 합니다.

정제를 단순화하기 위해 affinity purification tag를 관심 재조합 단백질에 fusion할 수도 있습니다(Nilsson et al. 1997).일반적인 fusion tag는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 추가되는 polypeptide, 저분자 단백질 또는 효소입니다. 서로 다른 tag의 생화학적 특성은 tag가 부착된 단백질의 안정성, 용해도 및 발현에 영향을 줍니다(Stevens et al. 2001). Fusion tag가 포함된 발현 vector를 사용하면 재조합 단백질 정제를 용이하게 할 수 있습니다.

단백질 complex 분리

Proteomics의 중요한 목표는 단백질 기능과 주요 세포 내의 과정을 담당하는 복잡한 네트워크의 구성을 규명하는 것입니다. Protein:protein interaction 분석을 통해 이러한 과정에 관여하는 세포 신호 전달 체계(cell signaling cascade)에 대한 의미 있는 통찰을 얻을 수 있으며, protein:nucleic acid interaction 연구를 통해 mRNA 조절, chromosomal remodeling 및 전사와 같은 생물학적 과정에 대한 중요한 정보를 밝혀낼 수도 있습니다. 예를 들어, transcription factor는 염색체의 특정한 인식 부위, 주로 유전자의 promoter에 결합하고 핵 내의 다른 단백질과 interaction 하여 전사 조절에 있어 중요한 역할을 합니다. 이러한 조절은 cell viability, 분화 및 성장에 필수적입니다(Mankan et al. 2009; Gosh et al. 1998).

Protein:protein interaction 분석은 단백질 구조 또는 기능을 저해하지 않으면서 고체 표면(solid surface)에 단백질을 적절한 방향으로 고정(immobilization) 하는 간단한 방법이 필요한 경우가 많습니다. 이러한 고정은 결합 능력을 간섭하지 않아야 하며 affinity tag를 사용하여 디자인할 수 있습니다. 단백질을 칩에 고정하는 방법은 protein:DNA interaction 및 protein:protein interaction을 분석하고 단백질 complex의 구성요소를 확인하는 데 많이 사용되는 접근 방법입니다(Hall et al. 2004; Hall et al. 2007; Hudson and Snyder, 2006). Functional protein microarray에는 일반적으로 고체 표면에 결합된 full-length단백질 또는 단백질 도메인(protein domain)이 포함됩니다. 형광 표지된 DNA는 array probe로 사용하며 이는 특정 probe에 결합하는 단백질을 확인하는 데 사용됩니다. Protein microarray는 protein:DNA interaction을 high-throughput 방식으로 확인할 수 있습니다. 또한 고정된 단백질을 protein pull-down assay에 사용하면 in vivo (mammalian 세포) 또는 in vitro에서 단백질 결합 파트너를 분리할 수 있습니다. 질량분석법(mass spectrometry)과 같은 downstream application에서는 단백질 결합 파트너 및 단백질 complex의 각각의 구성요소를 확인하기 위해 단백질 고정이 필요하지 않습니다.

Mammalian 세포에는 endogenous HaloTag® 단백질이 없기 때문에 false positive 또는 비특이적 interaction이 측정될 가능성이 최소화됩니다. 공유결합을 통한 capture 방법과 빠른 결합 속도(binding kinetic)의 조합이 기존의 affinity tag와 관련된 equilibrium 기반의 한계를 극복하고 낮은 발현 상태에서도 효율적인 단백질 capture가 가능합니다. 또한 안정성이 높은 HaloTag® protein:ligand interaction을 통해 SDS-PAGE 분석 전에 단백질 complex를 SDS sample buffer에서 boiling할 수 있습니다.

Magnetic resin을 이용한 Polyhistidine-Tagged 단백질의 빠른 정제

Magnetic resin을 이용한 Polyhistidine-Tagged 단백질의 빠른 정제

High-throughput으로 단백질을 정제하는 방법에 대한 수요가 증가하고 있습니다. Magnetic resin을 사용하면 여러 번의 원심분리 단계를 거치지 않고 여러 개의 튜브에 샘플을 순차적으로 옮길 필요 없이 affinity tagged 단백질 정제가 가능합니다. 우수한 단백질 purification resin을 정의하는 기준은 비특이적 단백질 binding 최소화, fusion protein에 대한 높은 결합력 및 fusion 단백질의 효율적인 회수입니다. MagneHis™ Protein Purification System은 이러한 기준을 충족하여 광범위한 분자량과 다양한 발현 수준의 단백질을 정제할 수 있습니다. 결합 입자의 자성으로 인해 하나의 튜브에서 crude cell lysate로부터 단백질을 정제할 수 있습니다. 또한 이 시스템은 high-throughput application에서 자동화된 liquid-handling 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

MagneHis™ Protein Purification System

MagneHis™ Protein Purification System은 paramagnetic 전하를 띠는 니켈 입자 (MagneHis™ Ni-Particles)를 사용하여 crude cell lysate에서 직접 polypeptide tagged 단백질을 분리합니다. Figure 2는 MagneHis™ Protein Purification System 프로토콜의 모식도를 보여줍니다. Polyhistidine-tagged 단백질은 1ml 미만의 배양액에서 소규모로 정제하거나 1L 이상의 배양액에서 대규모로 정제할 수 있습니다. Beckman Coulter Biomek® FX 또는 Tecan Freedom EVO® instrument와 같은 liquid handler 플랫폼을 사용하여 high-throughput으로 샘플을 처리할 수 있습니다. Polyhistidine-tagged 단백질은 native 또는 denaturing (2~8M urea 또는 guanidine-HCl) 조건에서 정제할 수 있습니다. Mammalian 및 insect 세포 배양 배지에 serum이 포함되어 있어도 단백질 정제에 영향을 주지 않습니다. 추가 정보 및 자세한 프로토콜은 Technical Manual #TM060 및 MagneHis™ Protein Purification System Automated Protocol을 참조하세요.

프로토콜: MagneHis™ Purification system을 이용한 박테리아 세포에서 발현된 단백질의 정제

필요한 Material:

• MagneHis™ Protein Purification System및 프로토콜
• 플라스크 또는 튜브용 37°C incubator
• Shaker
• Magnetic separation 스탠드
• 1M imidazole solution (pH 8.0; insect 또는 mammalian cell 또는 배양 배지 샘플 정제용)
• 추가 binding/wash buffer (많은 수의 insect cell, mammalian cell, 또는 배양 배지 샘플을 처리하는 경우 필요할 수 있음)
• Solid NaCl (insect 또는 mammalian cell 또는 배양 배지 정제용)

Denaturing 조건에서 정제. 박테리아 세포에서 발현되는 단백질은 insoluble inclusion body 형태로 존재할 수 있습니다. 단백질이 inclusion body에 존재하는지 확인하려면 Technical Manual #TM060에 설명된 대로 FastBreak™ Cell Lysis Reagent, 10X를 사용하여 lysis 단계를 수행합니다. 원심분리를 통해 cellular debris을 pellet으로 만들고, supernatant와 pellet을 gel 분석을 통해 polypeptide tagged 단백질이 어디에 존재하는지 확인합니다.

Insoluble 단백질을 효율적으로 분리하기 위해서는 denaturing 조건에서 정제해야 합니다. Polyhistidine-tagged fusion 단백질과 MagneHis™ Ni-Particle의 interaction은 3차 구조에 의존적이지 않으므로 2~8M guanidine hydrochloride 또는 urea와 같은 강력한 denaturant를 세포에 첨가한 denaturing 조건에서 fusion 단백질을 capture 하고 정제할 수 있습니다. 단백질이 aggregation 되지 않도록 전체 실험 과정은 denaturing 조건에서 진행해야 합니다. Promega는 고체 형태의 guanidine-HCl 또는 urea를 MagneHis™ Binding/Wash 및 Elution Buffer에 직접 첨가하여 denaturing buffer를 준비하는 것을 권장합니다. 자세한 정보는 Technical Manual #TM060을 참조하세요.

Note: FastBreak™ Cell Lysis Reagent와 denaturant를 함께 사용하지 마세요. Urea 또는 guanidine-HCl과 같은 denaturant를 사용하여 세포를 직접 lysis할 수 있습니다.

Insect 및 mammalian 세포에서 단백질 정제. 2 × 106cells/ml cell density에서 진행합니다. 조직 배양 용기에 부착된 세포를 긁어내고 이 세포 개수로 배양 배지에 resuspension합니다. 최대 10% serum이 함유된 배양 배지에서 세포를 처리할 수 있습니다. 위에서 언급한 ml당 세포 수를 초과한 샘플에서 진행할 경우 단백질 수율이 감소하고 비특이적 결합이 증가할 수 있습니다. 세포 배양 배지에 분비된 단백질의 경우, 정제 전에 배지에서 모든 세포를 제거합니다. 자세한 정보는 Technical Manual #TM060을 참조하세요.

Mammalian 세포에서 HaloTag® 단백질 정제

배양된 mammalian 세포는 적절한 post-translational modification을 통해 적절하게 folding된 기능적인 mammalian 단백질을 생산하는 데 적합한 환경을 제공합니다. 그러나 배양된 mammalian 세포에서 재조합 단백질의 발현 수준이 낮은 경우 문제가 발생합니다. 따라서 만족스러운 수율과 순도를 얻기 위해서는 crude cell lysate로부터 이러한 단백질을 선택적이고 더 효율적으로 정제해야 합니다. 대부분의 affinity tag 단백질 정제 방법에서 사용하는 평형상태에 기반한 결합은 (resin과의) 단백질 결합 및 결합되지 않은 단백질 상태가 지속적으로 전환된다는 것을 의미합니다. 이 평형상태는 tag의 단백질 농도 및 결합 친화도에 따라 달라집니다. 따라서 낮은 발현 수준에서는 결합 효율이 감소하여 fusion 단백질의 회수율이 낮아질 수 있습니다.

HaloTag® Mammalian Protein Purification Systems (Cat.# G6795 및 Cat.# G6790)은 모든 단백질에 유전적으로 fusion되어 mammalian 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현될 수 있는 HaloTag® 단백질 tag를 사용합니다. 세포 lysis 이후, HaloTag® fusion 단백질은 HaloLink™ Resin에 공유결합으로 capture 되고 비특이적 단백질은 washing을 통해 제거합니다. 타겟 단백질은 HaloTag® 단백질 tag와 타겟 단백질을 연결하는 amino acid linker 서열에 포함되어 있는 최적화된 TEV protease 인식 부위에서 특이적인 proteolytic cleavage를 통해 방출됩니다. Protease를 제거하기 위한 2차 단계가 필요하지 않도록, HaloTag®(HaloTEV Protease; Cat.# G6601)에 fusion된 TEV protease를 사용하여 HaloTag® fusion 단백질을 digestion 한 다음 HaloLink™ Resin에 공유결합으로 capture 하여 정제 과정을 간소화할 수 있습니다. 이 간단한 정제 과정에서는 buffer를 교환할 필요 없이 전체 과정에 약한 생리학적 buffer를 사용합니다.

E. coli에서 HaloTag® Protein 정제

HaloTag® Protein Purification System (Cat.# G6280)은 E. coli에서 N-terminal HaloTag® fusion 단백질로 발현되는 단백질을 공유결합을 통해 효율적이고 특이적으로 capture 할 수 있도록 합니다. Mammalian 세포에서 단백질 정제에 적합한 HaloTag® 단백질 특성 중 대부분은 E. coli 세포에서의 단백질 정제에도 적합한 특성입니다. pFN18A HaloTag® T7 Flexi® Vector (Cat.# G2751)와 pFN18K HaloTag® T7 Flexi® Vector (Cat.# G2681)를 비롯해, HaloTag® 단백질 및 polyhistidine을 dual tag로 사용할 수 있는 non-Flexi® vector를 포함한 E. coli용으로 특이적으로 설계된 다양한 발현 vector를 사용하면 HaloTag® fusion 단백질을 E. coli에서 발현시킬 수 있습니다. 이러한 non-Flexi® vector, pH6HTN His6HaloTag® T7 Vector (Cat.#G7971) 및 pH6HTC His6HaloTag® T7 Vector (Cat.# G8031)를 사용하면 multiple cloning site를 사용한 기존 방식의 cloning이 가능합니다. 이러한 dual tag vector는 HaloTag® 단백질의 공유결합 능력을 유지하면서 HaloTag® fusion 단백질의 정제를 가능하게 합니다. HaloTag® Protein Purification System을 사용하면 형광 HaloTag® Ligand를 사용하여 단백질 발현 수준을 gel 내에서 검출 및 정량을 쉽게 수행할 수 있습니다.

1. Armstrong, R.N. (1997) Structure, catalytic mechanism, and evolution of the glutathione transferases. Chem. Res. Toxicol. 10, 2–18.
2. Geisse, S. et al. (1996) Eukaryotic expression systems: A comparison. Protein Expr. Purif. 8, 271–82.
3. Gosh, S. et al. (1998) NFκB and Rel proteins: Evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu. Rev. Immunol. 16, 225–60.
4. Hall, D.A. et al. (2007) Protein microarray technology. Mech. Ageing Dev. 128, 161–7.
5. Hall, D.A. et al. (2004) Regulation of gene expression by a metabolic enzyme. Science 306, 482–4.
6. Hudson, M.E. and Snyder, M. (2006) High-throughput methods of regulatory element discovery. Biotechniques 41, 673–81.
7. Hutchens, T.W. and Yip, T.T. (1990) Differential interaction of peptides and protein surface structures with free metal ions and surface-immobilized metal ions. J. Chromatogr. 500, 531–42.
8. Lonnerdal, B. and Keen, C. (1982) Metal chelate affinity chromatography of proteins J. Appl. Biochem. 4, 203–8.
9. Mankan, A.K. et al. (2009) NF-kappaB regulation: The nuclear response. J. Cell. Mol. Med. 13, 631–43.
10. Mannervik, B. and Danielson, U.H. (1988) Glutathione transferases—structure and catalytic activity. CRC Crit. Rev. Biochem. 23, 283–337.
11. Nilsson, J. et al. (1997) Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 11, 1–16.
12. Porath, J. et al. (1975) Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258, 598–9.
13. Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67, 31–40.
14. Stevens, R.C. et al. (2001) Global efforts in structural genomics. Science 294, 89–92.
15. Terpe, K. (2002) Overview of tag protein fusions: From molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–33.
16. Yip, T.T. et al. (1989) Evaluation of the interaction of peptides with Cu(II), Ni(II), and Zn(II) by high-performance immobilized metal ion affinity chromatography. Anal. Biochem. 183, 159–71.