역전사 효소(Reverse Transcriptase) 선택하는 방법

역전사 효소는 각각 고유한 특성을 가지고 있으며, 특정 응용 실험에 적합한 효소를 선택하는 것이 중요합니다. 적합한 역전사 효소를 선택하기 위해서는 downstream 응용 연구, target RNA 길이, 복잡한 RNA 이차 구조의 존재 여부, 그리고 효소의 RNase H 활성 수준 등을 고려해야 합니다.

역전사 효소(RT)는 최초로 레트로바이러스 life cycle에서 발견된 RNA-directed DNA polymerase로(1–2) reverse transcription primer, dNTPs, Mg²⁺ 또는 Mn²⁺ 를 보조 인자로 사용하여 타겟 RNA 분자의 DNA 복사본(cDNA)을 합성합니다. 이후 과학자들은 이러한 효소를 real-time 및 endpoint RT-PCR, 라벨링된 cDNA probe 생성, cDNA 라이브러리 구축 등 다양한 in vitro application에 활용하고 있습니다. 모든 역전사 효소들이 cDNA 합성을 촉진하는 기능을 기본적으로 갖고 있지만 일부 효소는 특정 RNA 타겟과 downstream 응용 분야에 더 적합합니다. 실험에 가장 적합한 역전사 효소를 선택하는 것은 효소가 가지고 있는 기본적인 특성 및 타겟 RNA의 길이, 복잡한 RNA 이차 구조의 존재 여부, downstream 응용 분야, 그리고 효소의 RNase H 활성 수준과 같은 중요한 고려 사항을 이해하면 어렵지 않습니다. 이 글은 가장 널리 사용되는 역전사 효소들에 대한 선택 시 중요한 고려 사항들을 설명합니다.

Avian myeloblastosis virus (AMV) 역전사 효소는 실험실에서 가장 많이 사용되는 역전사 효소 중 하나입니다. 170kDa의 heterodimer인 AMV 역전사 효소는 활성을 위해 6 ~ 10mM Mg2+ 또는 Mn2+가 필요하며, full-length cDNA 합성을 증가시키고 hairpin 형성을 감소시키기 위해 반응물에 sodium pyrophosphate와 spermidine을 주로 사용합니다(3). AMV 역전사 효소는 Moloney Murine Leukemia Virus(M-MLV) 역전사 효소보다 강한 RNA 이차 구조에 의한 억제에 덜 민감합니다(4).

최적의 효소 활성 및 최대 cDNA 길이 합성은 42 ~ 48°C에서 이루어지지만, 반응 온도는 25°C에서 58°C까지 조절할 수 있습니다(5). 높은 반응 온도는 강한 RNA 이차 구조 영역을 변성시키는 데 도움이 되지만, 이는 역전사 효소의 활성을 저해하고 cDNA 크기를 제한할 수 있는 요인으로 작용합니다(6-7). 그렇기 때문에 AMV 역전사 효소는 강한 이차 구조를 가진 RNA를 역전사할 때 자주 사용됩니다. 다른 역전사 효소와 마찬가지로, AMV 역전사 효소는 gene-specific primer, oligo(dT)15 primer 또는 random hexamer와 호환되지만, random hexamer를 사용할 때는 반응 온도를 37°C로 낮추어야 합니다. 반응 온도가 42°C를 초과할 때는 42°C 이상의 높은 Tm을 가진 gene-specific RT primer 사용을 권장합니다.

높은 반응 온도는 강한 이차 구조 영역을 변성시키는데 효과적이지만, 이러한 온도는 RNA integrity에 안 좋은 영향을 줄 수 있습니다. RNA는 열에 민감하며 metal-catalyzed degradation에 취약합니다. 일반적으로 가수분해는 낮은 빈도로 발생하지만, 특정 조건(예: 최적화되지 않은 pH, 높은 온도, 2가 양이온 존재)에서는 RNA 가수분해가 문제가 될 수 있습니다. 따라서, 긴 RNA의 cDNA 합성을 진행할 때에는 RNA를 높은 반응 온도에 노출하지 않는 것이 좋습니다. RNA가 높은 온도에 노출되는 시간을 최소화하기 위해, AMV 및 M-MLV 역전사 효소를 사용한 cDNA 합성 프로토콜에서는 주로 초기 변성 단계를 포함하며, 이 단계에서 RNA와 RT primer를 결합시킨 후 이차 구조를 변성시키기 위해 잠시 가열하고 변성 상태를 유지하기 위해 얼음에서 빠르게 식힙니다. 그런 후 RT, Reaction Buffer 및 dNTPs를 추가하고 원하는 온도 조건에서 반응을 진행합니다.

AMV 역전사 효소가 보유하고 있는 고유한 RNaseH 활성은 RNA/DNA hybrid의 RNA 가닥을 분해하거나, 합성 중 RT 활성이 멈출 때 RNA template을 분해할 수 있습니다(8). 이는 총 cDNA 수율과 full-length cDNA의 비율을 감소시켜, AMV 역전사 효소가 5kb 이상의 RNA를 역전사 하는 것을 방해합니다.

AMV 역전사 효소가 보유하고 있는 고유한 RNaseH 활성은 RNA/DNA hybrid의 RNA 가닥을 분해하거나, 합성 중 RT 활성이 멈출 때 RNA template을 분해할 수 있습니다(8). 이는 총 cDNA 수율과 full-length cDNA의 비율을 감소시켜, AMV 역전사 효소가일반적인 RT-PCR 조건은 최대 5µg의 총 RNA 또는 최대 100ng의 polyA+ mRNA, 20 ~ 30 unit enzyme 및 42°C에서 60분간의 반응으로 구성됩니다. AMV 역전사 효소는 M-MLV 역전사 효소보다 processivity가 더 높기 때문에(5-6), 동일한 양의 cDNA를 생성하기 위해 더 적은 양의 enzyme이 사용됩니다. AMV 역전사 효소 25 unit은 약 200 unit의 M-MLV 역전사 효소와 동등한 활성도를 보입니다. PCR 전에는 AMV 역전사 효소를 비활성화해야 하며 이는 AMV 역전사 효소가 M-MLV 역전사 효소와 마찬가지로 Taq DNA polymerase를 저해할 수 있기 때문입니다(9). Enzyme은 70 ~ 100°C에서 가열한 후 얼음 위에서 5분동안 온도를 유지하여 비활성화시킬 수 있습니다. 역전사 반응 후에 생성된 cDNA는 PCR에 바로 사용하지 않고 희석하거나 소량만 사용하는 경우가 있으며 이는 spemidine이라는 화합물이 PCR을 저해할 수 있기 때문입니다(10). 소량의 cDNA을 사용하여 적은 양의 RNA를 검출하는 경우, 이러한 제한이 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

AMV 역전사 효소는 1-Step 및 2-Step RT-PCR 및 RT-qPCR, 5kb 미만의 RNA 역전사, primer extension에 권장되며, 특히 RNA template에 강한 이차 구조가 있을 경우 사용하기 적합합니다.

Moloney murine leukemia virus(M-MLV) 역전사 효소는 AMV 역전사 효소에 비해 RNaseH 활성이 낮아 긴 RNA(>5kb)의 역전사에 자주 사용됩니다. 그러나 37°C의 낮은 반응 온도에서 강한 이차 구조를 가진 RNA의 역전사는 어려울 수 있습니다. Wildtype M-MLV RT의 variation들이 존재하며 이 역전사 효소들은 RNaseH 활성이 없고 높은 반응 온도를 제공하기 때문에 널리 사용되고 있습니다. 가장 많이 사용되는 variation은 M-MLV RT RNase H– point mutation으로, 단일 아미노선 치환을 통해 RNase H 활성을 현저히 감소시키면서도 전체 DNA 중합효소 활성을 유지합니다(11). M-MLV RT RNase H– point mutation 또한 훨씬 더 열 안정성이 높습니다(5). Wildtype M-MLV RT의 최적 반응 온도가 37°C인 반면, M-MLV RT RNase H– point mutation은 최대 55°C에서 사용할 수 있습니다(5, 12). 이는 M-MLV RT RNase H– point mutation를 강한 이차 구조를 가진 RNA에 적합하게 만듭니다. 그러나 강한 이차 구조가 없는 경우, 낮은 반응 온도에서 더 긴 cDNA 생성물을 합성합니다.

많은 역전사 효소와 마찬가지로, M-MLV RT RNase H– point mutation은 많은 실험실에서 사용되는 일반적인 화학물질에 의해 억제됩니다. M-MLV RT RNase H– point mutation는 5%(v/v) formamide, 17%(v/v) DMSO, 34%(v/v) 글리세롤, 15mM guanidine isothiocyanate, 1mM EDTA, 0.0025% SDS 및 4µg/ml 헤파린에 의해 50% 억제됩니다. 또한 0.5mM spermidine 및 4mM sodium pyrophosphate에 의해 70%, 160mM guanidine hydrochloride, 70mM guanidine isothiocyanate, 2.5mM EDTA, 0.005%(w/v) SDS 및 30µg/ml 헤파린에 의해 90% 이상 효소 활성이 억제됩니다(13).

M-MLV RT RNase H– point mutation의 경우 RNase H 활성이 없기 때문에 긴 RNA를 역전사하여 cDNA 라이브러리 구축, cDNA probe 생성 및 primer extension을 수행하는 데 적합합니다.

GoScript™ Reverse Transcriptase는 M-MLV 역전사 효소와 효율적인 역전사를 위해 특별히 개발된 버퍼로 구성되어 있습니다. 희귀하거나 풍부한 transcript의 qPCR을 위해 다른 first-strand cDNA 시스템과 달리, 역전사 반응물의 20%까지 PCR 반응물에 추가해도 MgCl₂ 농도를 최적 수준(1.5 ~ 5mM에서 MgCl₂ 농도의 최적화를 권장함)으로 유지된다면 억제 효과가 없습니다. GoScript™ RT는 25 ~ 55°C에서 활성이 있으며, 37 ~ 42°C에서 가장 큰 활성을 보입니다.

GoScript™ Reverse Transcriptase는 1-Step 및 2-Step RT-qPCR에 최적화되어 있으며 희귀하거나 풍부한 타겟의 역전사에 적합합니다. 또한 많은 일반적 증폭 inhibitor의 존재 하에서도 우수한 성능을 발휘합니다.

1. Temin, H.M. and Mizutani, S. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226, 1211–3.
2. Baltimore, D. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumor viruses. Nature 226, 1209–11.
3. Krug, M.S. and Berger, S.L. (1987) First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods Enzymol. 152, 316–25.
4. Brooks, E.M. et al. (1995) Secondary structure in the 3´-UTR of EGF and the choice of reverse transcriptases affect the detection of message diversity by RT-PCR. Biotechniques 19, 806–12.
5. Gerard, G.F. et al. (2002) The role of template-primer in protection of reverse transcriptase from thermal inactivation. Nucleic Acids Res. 30, 3118–29.
6. DeStefano, J.J. et al. (1991) Polymerization and RNase H activities of the reverse transcriptases from avian myeloblastosis, human immunodeficiency, and Moloney murine leukemia viruses are functionally uncoupled. J. Biol Chem. 266, 7423–31.
7. Harrison, G.P. et al. (1998) Pausing of reverse transcriptase on retroviral RNA templates is influenced by secondary structures both 5´ and 3´ of the catalytic site. Nucleic Acids Res. 26, 3433–42.
8. Kotewicz, M.L. et al. (1988) Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity. Nucleic Acids Res. 16, 265–77.
9. Sellner, L.N., Coelen, R.J. and Mackenzie, J.S. (1992) Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20, 1487–90.
10. Ahokas, H. and Erkkila, M.J. (1993) Interference of PCR amplification by the polyamines, spermine and spermidine. PCR Methods Appl. 3, 65–8.
11. Tanese, N. and Goff, S.P. (1988) Domain structure of the Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: Mutational analysis and separate expression of the DNA polymerase and RNase H activities. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1777–81.
12. Gerard, G. et al. (1997) Reverse transcriptase. The use of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase to synthesize DNA from RNA. Mol. Biotech. 8, 61–77.
13. Gerard, G.F. (1994) Inhibition of SuperScript™ II reverse transcriptase by common laboratory chemicals. Focus 16, 102–3.