Guide to Immunoassays

ELISA는 96-well 혹은 384-well polystyrene plate와 같은 solid surface에 특정 타겟 항원을 고정시켜 검출하는 방법입니다. 다양한 ELSIA 방법이 있지만 모두 다음 단계를 포함합니다.

1. Coating: 특정 항원 혹은 항체를 solid surface에 부착
2. Probing: 항원 특이적 1차 항체와 항원 반응
3. Washing: 결합되지 않는 free 항원 및 항체 제거
4. Detection: 1차 혹은 2차 항체에 라벨된 효소로부터 발생하는 signal 측정

ELISA는 4가지의 주요 형태가 있으며 이는 항원/항체가 plate에 코팅된 방식과 signal을 감지하는 방식 (직접 또는 간접)에 따라 나누어집니다. 각 유형의 ELISA에서 측정되는 signal은 발색(colorimetric), 형광(fluorometric) 또는 발광(chemiluminescent)일 수 있습니다.

Direct ELISA는 항원을 직접 plate surface에 붙이고 detection label로 표지된 1차 항체와 반응시키는 방식입니다. 결과 signal은 1차 항체에서 직접 만들어지게 됩니다.

• 장점: signal 증폭이 가능함
• 한계점: direct ELISA와 비교하여 실험 단계 추가됨, 2차 항체의 cross-reactivity 가능성 존재함

Indirect ELISA는 항원을 직접 plate surface에 붙이고 direct ELISA 방식과 달리, 측정을 위해 1차 항체와 2차 항체를 모두 사용하는 방식입니다. 결과 signal은 detection label로 표지된 2차 항체로부터 얻게 됩니다.

• 장점: signal 증폭이 가능함
• 한계점: direct ELISA와 비교하여 실험 단계 추가됨, 2차 항체의 cross-reactivity 가능성 존재함

Sandwich ELISA는 타겟 항원의 서로 다른 epitope에 결합하는 2개의 1차 항체가 필요합니다. 1차 항체 중 하나는 plate surface에 붙이고 고정된 1차 항체에 타겟 항원을 결합시킨 다음 두번째1차 항체와 타겟 항원에 결합시켜 sandwich complex를 형성합니다. 결과 signal은 detection label을 표지한 두번째 1차 항체로부터 생성됩니다.

전통적인 sandwich ELISA 방법은 여러 단계의 washing이 필요합니다. 하지만 상용화된 일부 최신 “Fast ELISA” kit을 사용하면 항체-항원 sandwich complex가 한 단계로 형성될 수 있어 한 번의 washing 단계만 필요합니다. 이러한 ELISA kit의 단점은 특정 affinity tag이 부착된 항체로 코팅된 plate를 구입해야 한다는 점입니다.

• 장점: 반응 특이성과 감도 높음
• 한계점: 적합한 항체 쌍을 찾기 어려움

Competitive ELISA는 경쟁적 결합을 기반으로 디자인된 방법입니다. Reference 항원 또는 항체는 표지되지 않는 샘플의 항원 또는 항체와 동일한 결합 사이트에 경쟁적으로 결합합니다. 위에서 설명한 모든 ELISA 방법은 이러한 competitive format으로 적용할 수 있습니다. 한 예로, reference 항원은 plate surface에 미리 코팅한 다음, 표지된 항체와 혼합된 샘플 항원을 추가합니다. 샘플 항원과 reference 항원은 표지 항체에 결합하기 위해 경쟁하게 되며, 샘플 항원 농도가 높을수록 reference 항원에 결합하는 표지 항체가 적어지기 때문에 측정 signal은 낮아지게 됩니다.

• 장점: assay format의 유연성(flexibility), 샘플 희석 및 샘플 matrix에 의해 감도가 떨어짐, crude 샘플에 적용 가능함
• 한계점: format에 따라 다름

Radioimmunoassay는 detection label로 방사성 동위원소를 사용하며 competitive binding을 기반으로 측정됩니다. 먼저 방사성 물질로 표지된 항원 (“tracer”라고 함)이 항체와 반응하여 항원-항체 complex를 형성합니다. 그런 다음 표지되지 않은 항원이 포함된 샘플을 추가합니다. 표지되지 않은 항원은 항체 결합 부위에 경쟁적으로 결합하여 tracer를 대체하게 됩니다 (“free tracer”). Free tracer 및 항체 결합 tracer의 방사성 signal은 샘플 내 표지되지 않은 항원의 농도를 측정하는데 사용됩니다. 결합 tracer가 적고 free tracer가 많을수록 항원의 농도가 높다는 의미입니다.

• 장점: 감도가 높음
• 한계점: 방사선 노출 위험으로 인한 안전 위험, 방사성 폐기물 처리

FRET (Fluorescence resonance energy transfer) 기반의 immunoassay는 donor 형광 물질과 acceptor 형광 물질 사이의 에너지 전달을 기반으로 디자인된 방법입니다. 형광 물질은 target analyte에 결합될 때 근접하게 되는 두 개의 항체에 각각 conjugation합니다. Donor 형광 물질은 램프나 레이저와 같은 에너지원에 의해 excitation되어야 하며, 이를 위한 특수 장비가 필요합니다. Donor와 acceptor 형광 signal을 모두 측정하고 두 signal의 비율로 결과를 표시합니다. FRET 기반의 immunoassay의 변형된 형태는 background signal을 줄이고 signal의 안정성을 높이기 위해 alternate donor를 사용하는 time-resolved fluorescence (TR-FRET) 및 HTRF (homogenous time resolved fluorescence) 방법이 있습니다.

• 장점: homogenous assay format, 384-well format 적용이 가능함
• 한계점: signal을 측정하기 위한 별도의 장비가 필요함, 어두운 환경에서 실험을 진행해야 함

Lumit™ Immunoassays는 small bit (SmBiT)와 large bit (LgBiT)의 두 가지 subunit을 사용하는 protein complementary system인 NanoBiT® technology를 기반으로 디자인된 방법입니다. 이 두 subunit은 서로에 대한 affinity가 낮으며 가까이 근접했을 때만 두 subunit이 결합하여 active NanoBiT® luciferase가 만들어집니다. 특정 항원을 검출하기 위해 항체에 LgBiT 또는 SmBiT으로 표지하고 샘플과 반응시킵니다. 항체가 항원에 결합함에 따라 LgBiT과 SmBiT이 서로 가까워져 active luciferase가 형성되고, 여기에 기질이 포함된 detection reagent를 추가하면 타겟 항원에 비례적인 발광 signal이 생성됩니다. Lumit™ Immunoassay는 washing 단계 없이 1시간에 결과를 측정할 수 있습니다.

• 장점: 빠르고 washing 단계가 필요 없음, 높은 감도, 넓은 측정 범위(dynamic range), 미리 코팅된 plate 혹은 특수 장비가 필요 없음
• 한계점: serum 샘플에는 적용되지 않음