RNA Quality 측정 방법

High-quality RNA는 많은 downstream 응용 연구에 필수적입니다. 응용 분야에 따라 RNA quality 요구 사항은 크게 다를 수 있으며, 특정 응용 분야에 적합하지 않은 RNA도 다른 응용에는 적합할 수 있습니다. 예를 들어, microarray 실험은 특정 농도, 순도 및 integrity를 요구하는 반면, qPCR 기반 분석은 amplicon이 작기 때문에 상대적으로 낮은 quality의 샘플도 사용할 수 있습니다. 이러한 분석의 높은 비용을 고려할 때 RNA 샘플을 적절히 분석하여 downstream 실험 실패를 방지하고 추가 분석 비용을 줄이는 것이 중요합니다. RNA는 환경에 존재하는 RNase에 의해 매우 쉽게 분해되기 때문에, RNA를 다룰 때는 각별한 주의가 필요합니다. Downstream 실험에서 RNA를 성공적으로 사용하려면, RNA 추출 과정에서 신중한 처리가 필요하며, 샘플의 유형과 응용 분야에 적합한 정량 및 분석 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 정량 및 quality 분석에서 얻은 데이터를 정확하게 해석하는 것 역시 필수적입니다. 이 글에서는 RNA 정량 및 분석을 위한 주요 방법들을 소개하고, 각 방법의 개념과 장단점, 한계점에 대해 설명합니다.

자외선(UV) 흡광도는 DNA, RNA 또는 단백질 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 핵산의 주요 파장은 260nm, 280nm 및 230nm입니다. 260nm에서의 흡광도는 샘플에 존재하는 핵산의 양을 측정하며, 농도는 260nm 흡광 값과 특정 핵산의 흡광 계수(extinction coefficient)를 기반으로 한 환산 인자를 사용하여 계산할 수 있습니다(A260=1.0일 때 dsDNA는 50µg/ml, RNA는 40µg/ml, ssDNA는 33µg/ml). 방향족 아미노산은 280nm에서 빛을 흡수하므로, 이 파장에서의 흡광도는 샘플 내 단백질 양을 추정하는 데 사용됩니다. 핵산 추출 키트에 자주 사용되는 guanidine thiocyanate와 같은 오염 물질의 양을 측정하는 데는 230nm에서의 흡광도가 사용됩니다(그림 1). 또한, 320nm에서의 흡광도를 통해 샘플에 포함된 광 산란 성분을 검출할 수 있으며, 이 값은 260nm, 280nm 및 230nm에서 측정된 값에서 background signal로서 제외됩니다.

핵산 순도를 추정하기 위해, 핵산의 흡광도와 오염 물질의 흡광도의 비율을 계산합니다. 순도에 대한 허용 비율 값은 downstream 응용 분야에 따라 다르지만, 일반적으로 A₂₆₀/A₂₈₀ 비율은 1.8 ~ 2.2가 적절하며, A₂₆₀/A₂₃₀ 비율은 1.7 이상이 요구됩니다(그림 1). 일부 분석이나 응용 분야에는 권장되는 A₂₆₀/A₂₃₀ 비율이 있지만, 이 비율이 반드시 downstream 실험의 성공을 예측할 수 있는 것은 아닙니다. 한 가지 주의할 점은, 특정 제품을 사용하여 추출한 핵산의 경우, A230 값이 종종 일정하게 유지되지만 핵산의 양은 샘플 출처에 따라 달라질 수 있다는 것입니다. 따라서 소량의 핵산이 추출된 경우 A₂₆₀/A₂₃₀ 비율은 종종 감소할 수 있습니다.

흡광도를 측정하는 분광광도계는 일반적으로 큐벳을 사용하여 샘플을 분석하며, 보통 1ml 이상의 샘플이 필요합니다. 그러나 NanoDrop® (Thermo Scientific) 및 NanoVue™ (GE Healthcare) Spectrophotometer와 같은 기기는 소량의 샘플에서도 흡광도를 측정할 수 있도록 설계되었습니다. NanoDrop® 기기는 190 ~ 840nm의 파장 범위에서 흡광도를 측정할 수 있으며, 정확한 측정을 위해 0.5 ~ 2µl의 샘플만 필요합니다. RNA의 경우, NanoDrop® 기기는 최소 2ng/µl에서 최대 12,000ng/µl까지 검출할 수 있습니다. 넓은 검출 범위와 적은 샘플량 덕분에, 샘플을 측정하기 전에 희석할 필요가 없으며, 30초 이내에 단일 측정을 수행할 수 있습니다. 다른 정량 방법과 달리, 추가적인 시약이나 액세서리가 필요하지 않습니다.

흡광도를 사용하는 방법의 주요 단점은 특이성 부족 및 낮은 농도의 샘플을 정량하는 데 있어 감도의 부족입니다. 모든 종류의 핵산(dsDNA, RNA 및 ssDNA)은 260nm에서 빛을 흡수하며, 이 방법으로는 다양한 형태의 핵산을 구별할 수 없습니다. A₂₆₀/A₂₃₀ 비율을 사용하여 핵산 순도를 추정할 수 있지만, 흡광도만으로는 추출된 RNA에 포함된 genomic DNA의 양을 측정할 수 없습니다. 또한, 260nm 근처의 빛을 흡수하는 오염 물질이 샘플에 상당량 포함된 경우, 이러한 오염 물질 자체가 흡광도 값에 반영되어 핵산 농도가 과대 추정될 수 있습니다. 샘플의 특성이나 샘플 처리 및 준비 과정에서 RNA 샘플이 분해된 경우, 단일 뉴클레오타이드도 260nm 흡광도 값에 기여할 수 있기 때문에, RNA integrity의 변화는 이 방법으로 측정되지 않습니다.

핵산을 정량하기 위한 UV 흡광 측정의 대안으로, dsDNA, RNA 및 ssDNA에 결합하는 형광 dye를 이용하는 방법이 있습니다. 이 방법에서는 알려진 농도의 standard와 핵산 샘플을 형광 dye와 함께 혼합하여 준비합니다. 이때, dye는 핵산에 결합하여 구조적 변화를 일으키고, 해당 dye의 특정 파장에서 형광 값이 증가합니다. 형광을 측정한 후, 형광 값과 표준물질의 핵산 농도를 바탕으로 표준 곡선(standard curve, plate reader용) 또는 reference standard(휴대용 fluorometer용)를 작성합니다. 이후 unknown 샘플의 형광 값을 표준 곡선에 적용하여 선형 회귀 방정식을 통해 핵산 농도로 변환합니다. Quantus™ Fluorometer와 같은 휴대용 reader를 사용하는 경우 0.2ml PCR tube에서, GloMax® Discover System와 같은 microplate reader를 사용하는 경우 96-well plate에서 분석할 수 있습니다.

RNA 정량을 위한 형광 dye 기반 방법의 주요 장점은 높은 감도입니다. NanoDrop® Spectrophotometer는 최소 2ng/µl을 검출할 수 있지만, QuantiFluor™ RNA System과 같은 dye 기반 방법은 100pg까지 검출할 수 있습니다(즉, PCR tube 또는 96-well plate에서 100µl 샘플 = 1pg/µl). 그러나 dye 기반 방법은 NanoDrop® 기기가 12,000ng/µl까지 정량할 수 있는 것과 달리, 최대 2.5ng/µl까지 정량할 수 있습니다(그림 2). 핵산 함량이 높은 샘플에서 추출된 RNA는 dye 기반 방법을 사용하기 전에 희석이 필요할 수 있습니다. RNA 농도에 따라 1 ~ 100µl 샘플을 측정할 수 있어 downstream 응용 연구를 위해 소중한 샘플을 최대한 보존할 수 있습니다. Dye 기반 분석은 샘플을 dye와 혼합한 후 짧게 반응시킨 뒤, 몇 초 만에 결과를 측정하기 때문에 UV 흡광법 대비 상대적으로 빠르고 자동화할 수 있습니다.

형광 dye 기반 방법의 단점 중 하나는 template 특이성이 부족하다는 점이지만, 일부 형광 dye의 경우 다른 dye에 비해 높은 template 특이성을 제공하는 것도 있습니다. 특이성을 높이는 한 가지 방법은 샘플을 DNase로 처리하여 오염된 DNA를 제거함으로써 흡광 기반 방법과 비교해 template 특이성을 향상시키는 것입니다. QuantiFluor™ RNA System 및 Quant-iT™ RiboGreen® RNA Reagent에서 사용되는 dye는 RNA에만 특이적이지 않으며, DNA에도 결합할 수 있습니다. RNA 샘플에 DNA가 존재하는 경우, 핵산 농도가 높게 측정될 수 있습니다. 실제 RNA 농도를 측정하기 위해서는 측정 전에 RNA 샘플에 DNase 처리를 권장합니다. 예외적으로 Quant-iT™ RNA Assay는 RNA 특이적 dye를 사용하지만, 이 방법은 다른 분석법에 비해 민감도가 상당히 낮습니다. 예를 들어, 샘플 20µl를 사용하는 경우 검출 한계는 250pg/µl이며, 1µl 샘플을 사용하는 경우 5ng/µl입니다. 따라서, Quant-iT™ RNA Assay를 사용할 때는 RNA 양이 5ng 이상이어야 합니다.

형광 dye 기반 정량 방법은 RNA의 순도나 integrity 정보를 확인할 수 없지만 샘플에 존재하는 단백질의 양을 정량화하기 위한 별도의 dye 기반 시스템이 있습니다. 또한, 사용자는 unknown 샘플의 예상되는 핵산 농도 범위의 표준 곡선 또는 reference standard을 생성해야 합니다. 샘플 농도를 알지 못하는 경우, 정확한 정량을 위해 여러 표준 곡선(예: 고농도 또는 저농도)을 생성해야 할 수 있습니다. 그리고 다른 많은 실험실 화학물질과 마찬가지로, 이러한 형광 dye는 잠재적으로 유해할 수 있으며, 시약의 적절한 취급 및 폐기가 필요합니다.

DNA 및 RNA 분석의 가장 일반적인 방법 중 하나는 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동입니다. 샘플을 미리 준비된 겔에 로딩한 후 전류를 흘리면, 핵산 조각들이 크기에 따라 분리됩니다. 큰 조각은 겔 매트릭스를 더 천천히 이동하는 반면, 작은 조각은 더 빠르게 이동합니다. 분리된 조각이 포함된 겔을 EtBR, SYBR® Green 또는 SYBR® Gold와 같은 핵산에 결합하는 형광 dye로 염색하지만, 단 이 dye들은 RNA에 특이적이지 않습니다. 이후, 핵산에 결합된 형광 dye에 자극을 주어 분리된 조각을 시각화할 수 있습니다.

RNA 농도는 RNA 밴드의 상대적 형광 강도를 알려진 RNA standard과 비교하여 정성적으로 측정할 수 있으며, 또는 겔 이미지를 분석하는 소프트웨어를 사용하는 겔 밀도 측정(densitometry)을 통해 정량적으로 측정할 수 있습니다. RNA integrity에 대한 일반적인 정보는 주요 리보솜 RNA(rRNA) 밴드와 degraded RNA의 염색 강도에 따라 얻을 수 있습니다. 포유류의 rRNA의 경우, 28S:18S rRNA 비율이 2:1이면 일반적으로 양질의 RNA를 나타냅니다. RNA 샘플에 genomic DNA 오염 여부는 시각적으로 확인할 수 있으며, genomic DNA는 일반적으로 RNA보다 겔 매트릭스에서 훨씬 더 천천히 이동합니다(그림 3).

겔 전기영동을 통해 RNA를 분석하는 비용은 상대적으로 저렴하지만, 분석에는 상당한 작업량과 시간이 필요합니다. 일반적으로 RNA를 시각화하기 위해서는 최소 몇 나노그램의 RNA가 필요하지만, 검출 가능한 최소 양은 사용된 dye에 따라 달라집니다. EtBR 염색의 감도와 비교할 때, 변성 아가로스 겔에서 SYBR® Green II 및 SYBR® Gold dye의 감도는 각각 2.4배 및 7.9배로 더 높게 나타났습니다(1). 그러나 핵산에 결합되는 형광 dye들은 잠재적인 발암 물질입니다. 따라서 dye, 염색된 겔 및 dye와 접촉하는 모든 장비를 다룰 때 매우 주의해야 합니다. SYBR® Green II 및 SYBR® Gold dye는 EtBR보다 안전한 대안이긴 하지만, 적절한 세척 및 폐기 과정이 필요합니다(2).

겔 전기영동을 사용한 RNA 분석에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 이 방법은 RNA 샘플에 amplification inhibitor가 포함되어 있는지 여부를 확인할 수 없습니다. 그리고 RNA를 FFPE 샘플에서 추출한 경우, 28S:18S 비율은 RNA quality를 평가하는 데 유용하지 않을 수 있습니다.

2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)는 microfluidics 기술을 사용하여DNA, RNA, 단백질 및 세포를 샘플 전용 칩으로 분석하는 장비입니다. 이 시스템은 핵산 및 단백질을 분리하는 아가로스 및 아크릴아미드 겔의 소형화된 버전이라고 할 수 있습니다. 샘플을 형광 dye와 혼합하여 칩의 well에 주입하면 미세한 채널 내의 겔 매트릭스를 통해 이동하면서 전기영동에 의해 분리됩니다. 이후 샘플은 형광 signal로 검출되며, 데이터 분석 소프트웨어를 통해 전기영동 겔과 유사한 이미지를 생성하여 크기 측정 및 정량화를 수행합니다. 샘플은 1µl만 필요하며, 하나의 칩에서 11-12개의 샘플을 동시에 실행할 수 있고, 분석은 30 ~ 40분 내에 완료됩니다.

2100 Bioanalyzer는 특정 샘플 유형에 맞춘 다양한 키트를 제공합니다. dsDNA 분석을 위해 길이가 25bp에서 12,000bp에 이르는 dsDNA를 위한 키트와 저농도 샘플을 위한 키트가 제공됩니다. RNA 분석을 위해서는 small RNA 및 microRNA에 적합한 Small RNA Kit, 5 ~ 500ng/µl의 total RNA와 mRNA를 분석할 수 있는 RNA 6000 Nano Kit, 그리고 50 ~ 5,000pg/µl의 total RNA와 mRNA를 분석할 수 있는 RNA 6000 Pico Kit가 제공됩니다.

2100 Bioanalyzer와 다른 RNA 분석 방법의 차별 점은 RNA integrity을 측정할 수 있다는 점이며, 이는 RNA Integrity Number(RIN)로 표시됩니다. RIN 값을 측정하기 위해, 기기 소프트웨어는 28S 및 18S rRNA의 비율뿐만 아니라 RNA의 전체 전기영동 trace를 고려한 알고리즘을 사용합니다. RIN 스케일은 0에서 10까지이며, 10은 최대 RNA integrity를 나타냅니다. 28S 및 18S rRNA 피크의 비율도 제공되며 RNA가 degradation 될수록 28S 및 18S rRNA 피크의 높이는 감소하고, 더 작거나 degraded RNA 피크가 두드러지게 나타납니다. 심각하게 degraded RNA 샘플에서는 28S 및 18S 피크가 거의 보이지 않게 됩니다(그림 4). 소프트웨어는 알려진 농도의 RNA와과 unknown 샘플의 피크 영역을 비교하여 RNA 농도를 추정합니다. 또한, 겔과 유사한 이미지를 제공하여 조각 크기와 분포를 시각화하고, RNA ladder의 시각적 결과도 제공합니다. 2100 Bioanalyzer의 추가적인 장점은 small RNA 및 microRNA와 같은 중요한 연구 대상의 분리가 가능하다는 점입니다. 그러나 한 가지 단점은 샘플의 순도에 대한 정보를 제공하지 못한다는 점입니다. DNA 또는 단백질 오염 정도에 대한 정보가 필요한 경우, 별도의 DNA 또는 단백질 칩에서 샘플을 분석해야 합니다. 마지막으로, 2100 Bioanalyzer는 독특하고 강력한 기능을 가지고 있지만, 장비, 시약 및 칩의 비용이 일부 실험실에는 부담이 될 수 있습니다.

2100 Bioanalyzer에서 측정된 RIN 값은 일부 downstream 응용 분야(예: 작은 amplicon을 생성하는 RT-PCR 또는 RT-qPCR)에 적용하기에는 적합하지 않을 수 있으며, degraded RNA가 포함된 것으로 알려진 FFPE 샘플에서 추출한 RNA의 RIN 값 또한 실험에 유용하지 않습니다.

Quantitative PCR(qPCR)은 널리 사용되고 있는 핵산 정량화 방법입니다. 전통적인 endpoint PCR에서는 증폭된 산물의 양이 최종 증폭 사이클이 완료된 후에 측정됩니다. 이는 증폭이 종료된 시점, 즉 반응 성분이 고갈된 후에 이루어지기 때문에, 초기 물질의 양을 정확하게 반영하지 않을 수 있습니다. 반면, qPCR에서는 증폭된 산물의 양이 증폭의 지수 단계에서 실시간으로, 또는 각 매 증폭 사이클이 끝날 때마다 측정됩니다. 각 증폭 사이클 후 증폭 산물이 축적되며, 결국 background signal를 초과하여 감지 가능한 threshold에 도달합니다. 이 반응 중의 지점 또는 사이클을 Quantitative Cycle(Cq)이라고 하며, 일반적으로 background signal보다 표준 편차 10 이상의 높은 signal에서 설정됩니다.

증폭된 산물의 양은 DNA에 결합하는 형광 dye(예: BRYT Green®, SYBR® Green), 형광이 표지된 DNA probe(예: TaqMan® Assay, Molecular Beacon), 또는 형광이 표지된 DNA primer(예: Plexor® Systems)를 사용하여 측정됩니다. 정량은 상대적일 수 있으며, 이는 관심 유전자의 C_q 값을 reference 유전자의 C_q 값과 비교하거나, 절대값을 얻기 위해 알려진 양의 DNA standard를 샘플과 함께 분석하여 초기 물질의 정확한 DNA 양을 산출하는 방식입니다. 이론적으로, 각 사이클은 산물의 두 배 증가를 의미하며(100% 효율에서), 1 C_q 차이는 초기 물질의 두 배 차이를 의미하고, 3.3 C_q의 차이는 초기 물질의 10배 차이에 해당합니다.

RT-qPCR은 역전사(RT) 단계와 qPCR을 결합하여 샘플 내 특정 RNA 타겟의 양을 측정할 수 있습니다. 성공적인 RT-qPCR을 위해서는 primer 디자인이 매우 중요합니다. RNA(cDNA) 검출을 위해 intron을 포함하지 않고, 타겟 서열의 intron의 양 말단에 인접한 Exon 부위의 서열을 포함하는 primer를 디자인하여 사용할 수 있으며, RNA 샘플에서 DNA 오염을 검출하기 위해서는 intron서열이 포함된primer를 사용할 수 있습니다. 또한, RT 반응에 역전사 효소를 첨가하지 않은 control 반응은 DNA 오염 분석을 위해 권장됩니다. RT-qPCR은 매우 민감하며, 최적의 반응 조건 하에서 타겟 서열의 단일 copy도 검출할 수 있습니다. Amplicon 크기는 증폭 효율성을 높이기 위해 일반적으로 100 ~ 200bp로 설정됩니다. 다양한 길이의 amplicon을 생성하는 primer를 사용하여 RNA integrity를 확인할 수 있습니다. RNA가 degradation된 정도에 따라, 사이즈가 큰 amplicon을 성공적이고 일관되게 증폭하는 것은 어렵습니다. 따라서 degraded RNA의 경우, 보다 작은 amplicon 크기가 권장됩니다.

다른 색의 형광 물질로 각각의 primer 세트를 표지하여 단일 반응에서 여러 타겟을 분석하고, 샘플에서 PCR inhibitor의 존재 여부를 확인할 수 있습니다. RNA 샘플의 PCR inhibitor를 검출하려면, 샘플을 control DNA template와 primer가 포함된 반응에 추가합니다. Control DNA 단독의 C_q 값과 비교했을 때 C_q 값이 지연되면, 이는 downstream 응용 연구에 영향을 미칠 수 있는 PCR inhibitor가 존재를 확인할 수 있습니다(예: Plexor® 또는 TaqMan® inhibitor 분석). RT-qPCR은 주로 RNA 분석을 위한 downstream 실험으로 사용되지만, 다른 downstream 응용 연구를 위해 RNA를 정량하는 데에도 사용할 수 있습니다. Endpoint PCR 대비 qPCR과 RT-qPCR의 단점은 비용입니다. 실시간 분석을 위해서는 real-time PCR용 장비와 시약이 필요하기 때문입니다.

두 개의 RNA 추출 키트를 사용하여 마우스(Mouse의 간 FFPE 절편에서 RNA를 추출하였습니다(n=3). 추출된 RNA는 세 가지 방법으로 정량하였습니다(표 1).

Kit A와 Kit B로 추출된 RNA 농도는 평균적으로 유사하게 나타났습니다. 그러나 세 가지 다른 정량 방법을 통해 계산된 RNA 농도는 큰 차이가 있었으며, 2100 Bioanalyzer는 흡광 기반의 방법이나 dye 기반 방법보다 RNA를 훨씬 적게 측정했습니다. 또한, A₂₆₀/A₂₈₀ 비율은 두 키트 간에 유사했지만, A₂₆₀/A₂₃₀ 비율은 Kit B 샘플이 전반적으로 더 높게 나타나, Kit B를 사용하여 분리된 샘플이 더 높은 순도를 가지고 있음을 나타냈습니다.

2100 Bioanalyzer 분석에서는 두 키트 간의 RNA integrity 차이도 확인되었습니다(그림 5). FFPE 샘플은 일반적으로 대부분의 fragment가 500 base 이하 길이의 degraded RNA를 생성합니다. Kit B 샘플의 경우 약 27초 시점에 저 분자량의 degraded RNA 밴드가 명확히 보입니다. 반면, Kit A 샘플은 전반적으로 덜 명확한 저 분자량의 밴드와 함께 더 큰 분자량의 RNA smear를 보여줍니다. RNA integrity는 RIN 값으로 평가되며, 6개의 샘플 중 5개에서는 RIN 값이 측정되지 않았습니다. 따라서, Kit B의 RNA 샘플이 상대적으로 더 높은 순도를 가지는 반면, Kit A의 RNA 샘플은 2100 Bioanalyzer 겔 이미지 분석에서 시각적으로 확인할 수 있듯이 더 높은 integrity을 가지고 있음을 알 수 있습니다.

RNA 샘플의 증폭 효율을 평가하기 위해, RNA 특이적인 마우스 β2-microglobulin primer를 사용하여 RT-qPCR을 수행했습니다. 이 primer는 120bp의 amplicon을 생성합니다. 흡광도로 결정된 25ng의 input RNA를 사용하여 1-Step C_q 값을 보였습니다. 흡광도 데이터는 Kit B 샘플이 더 높은 quality를 가지고 있음을 나타냈지만, 2100 Bioanalyzer의 겔 이미지는 Kit A 샘플이 더 높은 integrity를 가지고 있음을 보여주었습니다. RT-qPCR을 사용한 세 번째 RNA quality 테스트에서 Kit A RNA 샘플이 Kit B 샘플보다 더 높은 효율로 증폭되었음을 확인했습니다.

RNA 샘플의 다양한 특성은 downstream 응용 연구 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. RNA 농도, 순도, integrity, DNA 오염, 그리고 핵산 추출 과정에서 흔히 사용되는 여러 다른 오염 물질의 존재 여부를 확인하는 것은 실험의 반복을 방지하고, 이에 따른 시약, 장비 및 인건비의 낭비를 피하기 위해 필수적입니다. 각 방법의 주요 장점을 고려하여 여러 분석 방법을 적용하면 RNA 샘플의 quality를 보다 완벽하게 이해할 수 있습니다(표 2에 요약됨). 한 가지 방법만 사용하는 것은 정보가 불완전할 수 있으므로, 각 방법의 한계를 이해하는 것이 실험의 성공 또는 실패를 궁극적으로 결정지을 수 있습니다.

1. Tuma, R.S. et al. (1999) Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: A dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Anal. Biochem. 268, 278–88.
2. Kirsanov, K.I. et al. (2010) SYBR Gold and SYBR Green II are not mutagenic in the Ames test. Mutat. Res. 699, 1–4.