발광 리소스 센터(Luminescence Resource Center)
반딧불이(firefly)의 빛나는 꼬리나 해안가에 부딪히는 밝은 푸른 파도처럼, 자연에서 마주치는 발광 현상은 우리에게 익숙한 빛의 모습입니다. 연구자들은 이러한 발광을 생화학 및 분자생물학 초기부터 생물학적 분석법 개발을 위한 강력한 플랫폼으로 활용해 왔습니다. 1991년, 프로메가는 최초로 luciferase assay 제품을 출시하였으며, 이후 다양한 발광 시스템을 기반으로 한 혁신적인 bioluminescent assay를 꾸준히 개발해 왔습니다.
발광이 어떻게 작동하는지, 형광과 어떤 차이가 있는지, 그리고 연구에 어떻게 활용되는지 자세히 알아보세요.
Luciferase 리포터 분석에 관심은 있지만 어떤 제품을 선택해야 할지 고민되시나요? 아래 가이드를 통해 실험 목적에 가장 적합한 제품을 선택해 보세요.
Bioluminescence란?
Bioluminescence는 생물체 내에서 자연적인 효소 반응을 통해 자연적으로 생성되는 발광 현상을 의미합니다. 이러한 반응은 반딧불이, 해파리, 박테리아 등 다양한 생물에서 관찰됩니다.
이 외에도 방사선에 의해 빛을 생성하는 방사선 발광(radioluminescence) (예: 신틸레이터)이나 전기에 의해 빛을 내는 전기발광(electroluminescence) 등 여러 형태의 발광이 존재합니다.
Bioluminescence는 어떻게 작동하나요?
Bioluminescence 반응은 화학 에너지를 빛 에너지로 전환하는 과정을 통해 이루어집니다. 대표적인 예로는 luciferase 효소에 의해 촉매되는 반딧불이의 발광 반응이 있습니다. 이 반응에는 루시페린(luciferin), 산소(O2), ATP의 반응물과 luciferase와 Mg2+의 촉매가 필요합니다.
Luciferase는 루시페린을 산화시켜 옥시루시페린(oxyluciferin)으로 전환되고, 이 과정에서 루시페린 분자가 높은 에너지 상태로 여기(excitation)됩니다. 이후 진동 완화(vibrational relaxation)를 거쳐 에너지가 감소하며, 최종적으로 기저 상태(ground state)로 돌아가면서 에너지를 빛의 형태로 방출하게 됩니다. 이 과정을 방출(emission)이라고 합니다.
이 luciferase-루시페린 반응은 대표적인 bioluminescence 시스템의 예이지만, 자연 상태의 luciferase 유전자는 유전자 리포터 분석이나 다른 생물학적 분석에 바로 사용하기에 최적화되어 있지 않았습니다. 1990년대, 프로메가의 과학자들은 유전공학 기술을 활용해 자연 유래의 반딧불이 luciferase 유전자를 지속적으로 개선해 왔습니다. 그 결과, 포유류 세포에서 안정적이고 균일하게 발현되며, 비특이적 반응을 최소화하고, 전사 활성의 변화를 빠르게 반영하는 고성능 시스템을 개발하였습니다.
Luciferase-루시페린 외에도, 다른 효소와 기질 조합을 통해 bioluminescence를 유도할 수 있습니다. 반응의 열역학적 및 반응 속도학적 특성에 따라 발광의 색상, 밝기, 지속 시간이 달라집니다. 예를 들어, 프로메가의 과학자들은 지향적 진화(directed evolution) 기술을 활용해 심해 새우(deep-sea shrimp)에서 유래된 bioluminescence 시스템을 NanoLuc® Luciferase로 개발했습니다. NanoLuc®과 furimazine이 반응할 때 생성되는 빛의 강도는 기존 반딧불이 luciferase 시스템보다 약 100배 더 밝아, 훨씬 더 선명한 신호를 제공합니다.
발광 반응에서 생성되는 빛의 신호는 다양한 분석 목적에 맞춰 설계된 시약과 결합하여 생물학적 반응이나 변화를 측정하는데 활용할 수 있습니다. 예를 들어, 유전자 리포터 분석에서는 luciferase 유전자를 관심 유전자(GOI-Gene of interest)의 조절 서열 하에 위치시키고, 루시페린과 ATP가 포함한 시약을 처리합니다. 이때 생성되는 빛의 양은 luciferase 발현량에 비례하며, 이는 곧 해당 유전자의 전사 활성도를 의미합니다. 이 외에도 bioluminescence assay는 세포 내 ATP 농도 및 변화, 혹은 루시페린 또는 기타 발광 기질의 방출 등을 정량하는 데 활용될 수 있습니다.
Bioluminescence과 형광의 차이점은 무엇인가요?
Bioluminescence와 형광은 모두 자연에서 관찰되는 빛의 현상이며, 생물학적 시스템을 분석하는 도구로 실험실에서도 널리 활용됩니다. 두 현상의 가장 큰 차이점은 여기(excitation) 에너지원입니다. Bioluminescence은 화학 반응에서 발생한 에너지로 빛을 발생시키는 반면, 형광은 광자(photon)에 의해 유도됩니다.
형광 방출(emission)은 일반적으로 발광보다 훨씬 밝을 수 있으며 이는 샘플에 여기 상태를 유도하는 광자를 빠르게 조사할 수 있기 때문입니다. 하지만 생물학적 분석에서는 이러한 광자 조사로 인해 background가 증가할 수 있습니다. 첫째는, 검출 장비(detection system)가 조사된 빛과 방출된 형광을 구분해야 하며, 둘째는 시료 내 다른 형광성 물질로 인한 간섭이 발생할 수 있기 때문입니다.
세포 현미경(cellular microscopy)이나 유세포 분석(flow cytometry)과 같은 기술에서는 광학 장치가 빛을 제한할 수 있기 때문에 높은 background 값이 큰 문제가 되지 않습니다. 이러한 경우 형광 세기가 분석의 핵심 요소이며, 형광이 일반적으로 사용됩니다.
반면, 광학 검출 장비(optical detection instrument)가 더 간단하고 분석해야 할 샘플 수가 더 많은 경우에는 낮은 background가 중요합니다. 이러한 경우 발광은 생물학적 분석에 더 유용한 도구가 될 수 있습니다.
Bioluminescent Assay의 장점은 무엇인가요?
민감도(Sensitivity)
Bioluminescent assay의 가장 큰 장점 중 하나는 탁월한 민감도입니다. 대부분의 진핵 세포는 스스로 빛을 내지 않기 때문에, 발광 반응으로 생성된 빛의 세기는 background 신호보다 훨씬 높게 나타납니다. 이로 인해 bioluminescence는 signal-to-background 비율이 매우 높으며, 일반적으로 10–20 mole 수준의 낮은 농도까지 측정할 수 있습니다. 이는 일반적인 생물학적 샘플에서 세포당 단 몇 개의 분자만으로도 검출이 가능하다는 의미입니다. 이처럼 민감도가 높기 때문에, 내인성 발현 수준(endogenous expression level)에서도 신호 검출이 가능하며, 실제 세포의 생물학적인 상태를 더 정확하게 반영할 수 있습니다.
동적 범위(Dynamic Range)
Bioluminescence assay는 생성되는 빛이 매우 밝기 때문에, 넓은 동적 범위를 제공합니다. 대부분의 bioluminescent assay에서는 기질 농도에 따라 6~8 log 범위에서 선형적인 반응(linear response)을 나타냅니다. 이러한 넓은 범위의 신호를 안정적으로 정량하기 위해 사용되는 장비는 luminometer입니다.
High-Throughput Assays
Bioluminescence는 높은 민감도와 넓은 선형 동적 범위를 기반으로, 실험을 소형화하여 중간 규모부터 high-throughput plate 포맷, 심지어 1536-well plate까지도 유연하게 적용할 수 있습니다. 프로메가의 연구진은 bioluminescent 반응을 “add-mix-measure” 방식으로 최적화하여, 간편한 정량 분석이 가능하도록 하였습니다. 이 방식은 high-throughput assay 포맷을 간소화하였습니다.
유연한 분석 설계(Flexible Assay Design)
자연 상태의 반딧불이의 bioluminescent 반응은 약 2분의 반감기를 가지는 짧은 flash-type 신호를 생성합니다. 프로메가의 과학자들은 더 오래 지속되는 bioluminescent 신호를 제공하는 시스템을 개발해 왔습니다. Flash-type assay는 반감기가 약 10분으로 짧지만, 상대적으로 밝은 밝기를 생성합니다. 반면, glow-type assay는 신호의 세기는 다소 낮지만, 수 시간에 걸쳐 안정적으로 신호를 제공합니다. 이러한 발광 시약들은 배양 세포에 직접 처리하여, 샘플 전처리 과정 없이 low-throughput부터 high-throughput까지 호환 가능한 “add-mix-measure” 분석을 가능하게 합니다.
다양한 생물학적 과정과 신호 연동 가능
Bioluminescence assay의 또 다른 장점은, 발광 반응에서 생성되는 빛의 세기가 반응 구성 성분의 농도에 따라 달라진다는 점입니다. 이러한 특성을 활용하면 발광 반응을 생물학적 과정과 직접 연동시켜, 세포 사멸(cell death), 유전자 발현, 단백질-단백질 상호작용, kinase 활성과 같은 분자 수준의 현상을 측정할 수 있습니다.
Bioluminescent assay가 연구에 어떤 해답을 줄 수 있을지 궁금하신가요?
프로메가는 30년 이상 축적된 발광 및 bioluminescent assay 개발 경험을 바탕으로, 다양한 연구 목적에 최적화된 솔루션을 제안해 드립니다.
연구에 발광 분석을 어떻게 활용할 수 있을까요?
프로메가는 연구자의 다양한 과학적 질문에 직접적인 해답을 제공할 수 있도록, 다양한 bioluminescent assay를 지속적으로 개발해 왔습니다. 아래 자료를 확인하시고, 연구 목적에 가장 적합한 분석법을 선택해 보세요.
발광 기술이 실제로 연구에 어떻게 활용되는지 직접 보고 싶으신가요? 아래 영상들을 통해, 과학자들이 bioluminescent assay를 어떻게 연구에 적용했는지 확인해 보세요.
HT 스크리닝을 위한 생리학적으로 관련 있는 3D 간 모델 개발
Swansea University의 Samantha Llewellyn 박사는 CellTiter-Glo® 3D Assay를 활용하여 3D 세포 간 모델을 개발하고 있습니다. 3D 세포 배양 모델에 최적화된 bioluminescent assay에 대해 더 알아보시려면, 3D 세포 배양 입문 가이드(Introduction to 3D Cell Culture)를 확인해 보세요.
Live cell에서 Lysate까지: NanoBiT® 기술의 생화학적 assay 포맷으로의 확장
Francis Crick Institute의 Mohammad Ismail 박사는 NanoBiT® Protein:Protein Interaction assay를 활용하여 암 치료제 타겟에 대한 small molecule inhibitor를 탐색하고 있습니다. NanoBiT® 기술이 biochemical assay에 어떻게 적용되었는지 자세히 알아보세요.
발광 이미징으로 생물학적 변화를 시각화하세요.
Live-cell 이미징은 기존 발광 분석에 세포 내 반응의 시간적·공간적 시각화를 더해줍니다. 실시간으로 발광 신호의 시각화를 통해 세포 내에서 일어나는 역동적인 생물학적 과정을 더 깊이 이해할 수 있습니다.
GloMax Galaxy Bioluminescence Imager는 단백질 간 상호작용, 타겟 결합(target engagement) 등 다양한 생물학적 현상을 효과적으로 시각화하고 모니터링할 수 있는 장비입니다. *본 장비는 연구 전용으로, 진단 목적으로는 사용할 수 없습니다.
발광은 어떻게 측정하나요?
발광을 측정하는 데 가장 널리 사용되는 장비는 luminometer입니다. 이 장비는 일반적으로 흡광도나 형광을 측정하는 장비에 비해 구조가 단순한 것이 특징입니다. 왜냐하면 luminometer는 빛을 조사하는 광원이나 필터가 필요 없고, 오직 빛을 감지하는 검출기(light detector)만 필요하기 때문입니다. 또한, 대부분의 luminometer는 특정 파장의 빛만을 선택적으로 측정할 필요 없이 가시광선 전체 영역에서 빛을 수집할 수 있어 높은 signal-to-background 비율을 제공합니다.
Luminometer는 plate reader 형식 또는 단일 튜브 리더 형식으로 제공됩니다. GloMax® Discover나 GloMax® Explorer®와 같은 일부 장비는 발광, 형광, 흡광 측정이 모두 가능합니다. Plate reader 형식의 luminometer는 각 microplate well에 light collector가 장착되어, 인접한 well 간의 빛의 간섭(crosstalk)을 방지, 하는 기능도 포함되어 있습니다.
발광 분석을 수행할 위해 추가로 고려해야 할 두 가지가 있습니다.
Microplate reader를 사용하는 경우, 빛을 반사를 통해 신호를 극대화하려면 불투명 흰색(opaque white) microplate 사용을 권장합니다. Well 바닥은 불투명하거나 투명한 형태 중에서 선택할 수 있습니다.
"glow-type" 신호가 아닌 "flash-type" 신호를 생성하는 발광 분석법을 사용하는 경우, injector 장비가 더 필요합니다. Injector는 발광 반응을 유도하기 위해 필요한 기질을 자동으로 주입하고, 주입하는 시점과 luminometer의 측정 시점을 정밀하게 동기화합니다.
