NanoLuc® Luciferase

NanoLuc® luciferase는 심해 새우에서 유래된 19.1kDa 크기의 작고 안정적인 효소로, 발광 리포터로서 최적의 성능을 발휘하도록 설계되었습니다. 이 효소는 새로운 기질인 furimazine과 반응하여 기존의 firefly (Photinus pyralis) 또는 Renilla (Renilla reniformis) luciferase보다 약 100배 더 밝은 glow-type 발광을 생성합니다. 이 발광 반응은 ATP에 의존하지 않고 background 발광을 억제하도록 설계되어 분석 민감도를 극대화합니다. NanoLuc®은 전통적인 유전자 리포터로 활용되는 것은 물론, 매우 작은 크기와 탁월한 밝기로 인해 단백질 융합 파트너로도 적합해, 살아있는 세포 내 단백질 역학 연구에도 널리 활용되고 있습니다.

NanoLuc® Binary Technology(NanoBiT)은 NanoLuc® luciferase를 기반으로 한 구조적 상보성 리포터 시스템입니다. 이 기술은 최적화된 LgBiT 서브유닛(18kDa)과, LgBiT에 다양한 결합 친화도를 가질 수 있도록 설계된 11개의 아미노산으로 구성된 작은 상보성 펩타이드 서브유닛으로 이루어져 있습니다. 이 중 낮은 친화도의 펩타이드는 SmBiT라 불립니다. 세포 내 단백질 간 상호작용을 연구하기 위해, 관심있는 두 단백질에 각각 LgBiT과 SmBiT을 융합하여 세포 내에서 발현시킵니다. 두 단백질이 상호작용하면, 이 LgBiT과 SmBiT이 결합하여 활성화된 NanoBiT® enzyme을 형성하고, Nano-Glo® 기질이 존재하는 조건에서 밝은 발광 신호를 생성합니다. 이 기술은 살아 있는 세포에서 실시간으로 단백질:단백질 상호작용을 민감하고 특이적으로 분석할 수 있게 해줍니다.

낮은 친화력을 가진 LgBiT과 SmBiT 서브유닛은 면역 검출용으로 추가로 최적화되어 Lumit® Immunoassays 기술로 확장되었습니다. 이 구성에서는 항체에 LgBiT 또는 SmBiT을 화학적으로 결합시킵니다. 이렇게 라벨링된 항체가 타겟 분석물(analyte)에 결합하면 SmBiT과 LgBiT이 근접하게 되어, 활성화된 NanoBiT® luciferase가 형성되고, Lumit 검출 시약이 존재할 때 발광 신호가 생성됩니다. Lumit® 면역분석은 washing 단계가 적어 기존 ELISA에 비해 간편한 대안이 될 수 있으며, 사이토카인과 글루카곤 등 다양한 주요 타겟에 대해 direct, indirect, competitive 결합 방식은 물론 DIY 형식으로도 개발되었습니다.

LgBiT은 높은 친화도를 가지는 소형 서브유닛인 HiBiT과도 상보적으로 결합하여, 이를 활용한 HiBiT Protein Tagging System도 개발되어 있습니다. 이 시스템에서는 LgBiT과 HiBiT이 자발적으로 결합해 밝은 발광을 생성하는 NanoBiT® 효소를 형성합니다. HiBiT은 정량분석이 가능한 단백질 태그로 사용되며, 전통적인 클로닝 방식이나 CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 통해 내인성 유전자에 삽입할 수 있습니다. HiBiT 태그가 결합된 융합 단백질은 LgBiT이 포함된 검출 시약으로 확인하거나, LgBiT과 함께 발현하는 살아 있는 세포에서 직접 검출할 수 있습니다. 또한, 고감도의 anti-HiBiT 단클론 항체를 이용한 검출도 가능합니다. HiBiT 단백질 태깅 시스템은 높은 민감도로 내인성 수준에서 발현되는 소량의 단백질까지 정확하게 검출할 수 있는 간편하고 유연한 단백질 검출 솔루션입니다.

NanoBRET® 기술은 bioluminescence resonance energy transfer (BRET)에 기반한 방법으로, 살아 있는 세포에서 단백질:단백질 상호작용 또는 화합물의 타겟 결합(engagement)를 측정하는 데 사용됩니다. NanoLuc® luciferase는 매우 밝은 신호와 좁고 blue-shifted emission 스펙트럼을 지니고 있어, BRET 분석에 최적인 에너지 donor입니다. NanoBRET® Protein:Protein Interaction Assay에서는 한 단백질을 NanoLuc® luciferase에 융합하여 발현시키고, 다른 단백질은 세포 투과성이 있는 NanoBRET® 618 ligand로 라벨링되는 HaloTag® 융합 단백질로 발현시킵니다. 밝고 blue-shifted donor 신호와 최적화된 red-shifted acceptor 사이의 스펙트럼 중첩이 뛰어나 기존 BRET 분석에 비해 더 높은 신호와 낮은 background 신호를 제공합니다. NanoBRET® 기술은 다양한 주요 타겟에 대해 사전 설계된 분석 키트, DIY 시스템, 맞춤형 PPI 분석 개발 서비스 형태로도 제공됩니다.

NanoBRET® 기술은 살아 있는 세포에서 화합물의 타겟 결합을 측정하는 데에도 활용됩니다. 이러한 분석을 NanoBRET® Target Engagement (TE)라고 하며, 타겟 단백질을 NanoLuc® luciferase에 융합된 형태로 세포 내에서 발현시키고, 해당 단백질에 가역적으로 결합할 수 있는 세포 투과성 형광 NanoBRET® tracer를 첨가합니다. 이 tracer가 NanoLuc® 융합 단백질에 결합하면 에너지가 전달되어 BRET 신호가 발생하고, 테스트 화합물이 타겟 단백질에 결합하면 tracer와 경쟁하게 되어 NanoBRET® 신호가 감소하며, 이를 통해 세포 내에서의 화합물 친화도(affinity)를 정량적으로 측정할 수 있습니다. NanoBRET® TE는 부분 점유율(fractional occupancy), 화합물 선택성(compound selectivity), 세포 내 가용성(intracellular compound availability), 결합 지속 시간(residence time) 등을 계산하는 데도 활용됩니다. 최근에는 NanoBRET® TE 시스템에 재조합된 NanoBiT® luciferase를 에너지 donor로 사용하는 구성도 도입되어, 세포 내 단백질 복합체를 기반으로 한 타겟 결합 연구도 가능해졌습니다. 340개 이상의 kinase를 포함한 다양한 주요 약물 타겟에 대해 사전 설계된 분석 키트, DIY 툴, 맞춤형 분석 개발, 세포 기반 kinase selectivity 프로파일링 서비스도 함께 이용하실 수 있습니다.