NanoBRET® Target Engagement

Target Engagement(타겟 결합)는 화합물이 살아있는 생명 시스템 내에서 특정 타겟 단백질과 결합하거나 상호작용하는 과정을 의미합니다. 이러한 target engagement assay는 타겟 검증(target validation), 구조-활성 관계(SAR, Structure-Activity Relationship) 확립, 작용 기전(MOA, Mechanism of Action) 확인 등 신약 개발의 여러 단계에서 필요합니다.

Promega는 이러한 분석을 위해 NanoBRET® Target Engagement Assay라는 혁신적인 live-cell 기반 결합 분석법을 개발하였습니다. 이 기술은 생물발광 공명 에너지 전달(BRET, Bioluminescence Resonance Energy Transfer) 기술을 기반으로, 살아있는 세포 내에서 타겟 단백질과 소분자 화합물 간의 결합을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 이러한 에너지 전달은 다음의 두 가지 요소에 의해 이루어집니다:
1. NanoLuc® Luciferase가 융합된 타겟 단백질의 세포 내 발현
2. 타겟 단백질에 가역적으로 결합하는 세포 투과성이 뛰어난 형광 NanoBRET® tracer

도입 방법
중요 약물 타겟에 대해 최적화된 NanoBRET® Target Engagement (TE) Assay Kit 제공: 바로 사용 가능한 분석 시스템으로 다음과 같은 타겟에 적용 가능합니다:

• 주요 약물 타겟에 최적화된 ready-to-use 형태의 NanoBRET® TE Assay 제공:
• 340종 이상의 kinase 타겟
• CRBN 및 VHL E3 ligase
• 주요 돌연변이를 포함한15종의 RAS 이합체(RAS Dimers)
• 프로토머(protomer) 및 동종이합체(homodimer)를 포함한5종의 RAF 이합체(RAF Dimers)
• 9종 이상의 HDACs 및BRDs 단백질
• 10종 이상의 PARP
• NLRP3 인플라마좀(Inflammasome)
• NanoBRET® 590 Dyes를 사용하여 chemical probe 또는 DEL hit 화합물로부터 새로운 tracer를 합성할 수 있습니다.
• Promega 서비스 팀과 협업하여 화합물 프로파일링(compound profiling) 또는 새로운 분석법 개발도 가능합니다.

기존의 세포 기반 타겟 결합 분석법과 달리, NanoBRET® TE assay는 단순한 효능(potency) 측정에 그치지 않고, 세포 내 화합물의 결합 친화도(또는 apparent K_i)를 정량적으로 분석할 수 있는 차별화된 기술입니다. 정량적 결합 친화도 측정은 NanoBRET® tracer의 K_d 값 이하의 적절한 농도를 사용하는 것이 필수적입니다. Promega는 각 타겟 단백질에 최적화된 NanoBRET® TE assay를 제공하며, 여기에 사용되는 tracer의 세포 내 세포 내 친화도(apparent intracellular affinity)와 권장 농도도 함께 제공합니다.

또한, NanoBRET® TE Assay는 부분 점유율(fractional occupancy) 측정도 가능합니다. 실험 조건과 대조군을 적절히 설정하면 BRET 비율을 점유율로 환산할 수 있으며, 이 점유율 데이터를 통해 동일 계열의 유사한 타겟 (예: kinase) 간의 화합물 선택성(selectivity)을 정량적으로 비교할 수 있습니다.

NanoBRET® TE 기술의 주요 장점 중 하나는 살아 있는 세포 내에서 유사한 여러 단백질이나 돌연변이 단백질을 대상으로 화합물의 선택성을 정량적으로 평가할 수 있다는 점입니다. 이는 NanoBRET® TE assay가 세포 내에서 각 타겟에 대한 화합물의 결합률(fractional occupancy)과 친화도(affinity)를 정량적으로 측정할 수 있기 때문에 가능합니다(위 내용 참고). 예를 들어, NanoBRET® TE Intracellular RAS Assay를 활용하면, 특정 RAS 리간드의 세포 내 친화도를 15가지 KRAS 및 HRAS 변이에 대해 평가할 수 있습니다.

수백 개 이상의 타겟 단백질을 대상으로 화합물의 선택성 프로파일링을 수행하려면, 단일 농도의 화합물로 모든 타겟에 대한 결합률을 동시에 측정할 수 있는 NanoBRET® TE 기술의 특성이 매우 중요합니다. 이러한 선택성 분석의 대표적인 예로는 NanoBRET® TE K192 Kinase Selectivity System이 있으며, 이 시스템은 전체 kinase 군(kinome)을 대표하는 192종의 kinase 패널로 구성되어 있습니다. 이 시스템을 통해 관심 화합물의 각각의 kinase에 대해 세포 내에서 어느 정도 결합하는지를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 우리는 이 같은 세포 기반 NanoBRET® assay에서전통적인 생화학적(in vitro) 접근법보다 향상된 화합물 특이성이 관찰되는 경우를 자주 확인하고 있습니다. 또한 CDK 계열에 특화된 선택성 프로파일링에는 NanoBRET® TE CDK Selectivity Systems 를 활용할 수 있습니다.

Kinase 선택성 분석을 의뢰하고 싶으신가요? Promega Tailored R&D Solutions 팀은 NanoBRET® TE Assay를 기반으로 K192 패널 또는 확장된 kinase 패널을 포함한 다양한 타겟에 대한 화합물 프로파일링 서비스를 제공합니다.

NanoBRET® TE assay는 살아 있는 세포에서 화합물의 결합 지속 시간(residence time)을 평가할 수 있는 독자적인 기능을 제공합니다. 이 측정은 NanoLuc® luciferase와 융합된 타겟 단백질을 발현하는 세포에, 포화에 가까운 농도의 화합물을 처리해 평형 상태를 유도하는 단계로 시작됩니다. 이후 결합되지 않은 화합물을 제거한 뒤, 역시 포화에 가까운 농도의 NanoBRET® tracer를 처리합니다. Tracer의 결합은 시간에 따라 추적되며, 타겟 단백질로부터 천천히 해리(dissociation)하는 화합물일수록 tracer의 결합을 더 오래 방해하게 되어, 결과적으로 BRET 신호의 생성 속도가 느려지게 됩니다. 이러한 실시간 결합 동역학 추적과 세포 기반 약물-타겟 결합 지속 시간 분석은, 빠르게 결합하는 NanoBRET® tracer와 신호 반감기가 긴 NanoLuc® Luciferase의 특성으로 인해 가능해집니다.