NanoLuc® Luciferase, Reporter Assay 그 이상을 제공합니다.

게시일 : 2020년 05월 05일

작고 밝은 luciferase로 우리는 무엇을 할 수 있을까요? 작고 매우 밝은 luciferase인 NanoLuc® luciferase는 promoter 활성을 측정하기 위한 genetic reporter assay로 처음 도입되었지만, genetic reporter 이상으로 기능이 확장되어 단백질 결합(protein interaction), target engagement, 단백질 분해(protein degradation), immunodetection 등의 연구에 사용되는 bioluminescent tool로 개발되어 사용되고 있습니다. 그렇다면 NanoLuc® luciferase는 어디에서 유래되었으며 하나의 luciferase로부터 어떻게 다양한 기술이 개발되었을까요?

NanoLuc® luciferase 이야기는 심해 새우(deep sea shrimp)와 Promega 과학자에 의해 진화된 발광 효소(bioluminescent enzyme)와 기질로부터 시작됩니다. 그 결과 firefly 혹은 Renilla luciferase보다 100배 더 밝고 안정적인 “glow-type”의 발광 signal을 생성하는 19kDa의 작은 크기의 NanoLuc® luciferase가 개발되었습니다. 작고 밝은 NanoLuc® luciferase은 기존의 genetic reporter assay 뿐만 아니라 단백질 fusion reporter로도 사용 가능한 감도 높은 reporter luciferase입니다. 또한 NanoLuc® luciferase의 작은 크기는 바이러스 패키징(viral packaging)에 영향을 덜 미치기 때문에 luciferase를 포함한 reporter 바이러스 제작이 용이하며 CRISPR/Cas9 유전자 편집(gene editing) 기술을 사용하여 내인성(endogenous) 단백질의 발현을 쉽게 측정할 수 있습니다. 이러한 NanoLuc® luciferase가 어떻게 개발되었는지 article에서 확인할 수 있습니다. 밝은 NanoLuc® luciferase는 분자의 근접성(molecular proximity)를 측정하는 BRET (bioluminescence resonance energy transfer) assay에 이상적인 발광 donor입니다. 우리는 한 단계 더 나아가 NanoLuc® luciferase와 함께 HaloTag® 단백질과 최적의 형광 ligand를 사용하여 NanoBRET™ assay를 개발하였습니다. 밝은 blue-shifted signal을 생성하는 NanoLuc® luciferase donor와 far-red-shifted HaloTag® acceptor를 사용하여 기존의 BRET 방법 대비 최적의 spectral overlap, 증가된 signal 및 낮은 background를 가지는 protein interaction assay를 개발하였습니다. 이 article에서는 살아있는 세포에서 protein:protein inteactin (PPI) 측정이 가능한 NanoBRET™ assay가 어떻게 개발되었는지 설명하고 있습니다.

NanoBRET™ technology는 PPI 측정 뿐만 아니라 화합물(compound)이 단백질에 얼마나 강하게 결합하는지 (compound affinity), 얼마나 많은 화합물이 단백질에 결합하는지 (target protein occupancy)를 측정하는 live cell target engagement (TE) assay로 확장되었습니다. 생리학적 조건에서 화합물이 타겟 단백질에 결합하는 시간 (residence time)을 측정할 수도 있습니다. NanoBRET™ technology를 사용하여 살아있는 세포에서의 target engagement를 측정하는 방법은 해당 링크를 통해 자세히 확인할 수 있습니다.

BRET 기법을 이용한 단백질 interaction을 측정하는 방법 외에 NanoLuc® luciferase를 사용한 또 다른 방법은 두 개의 enzymatic subunit 결합에 의해 밝은 발광 효소(luminescent enzyme)가 생성되는 complementation-based PPI method입니다. NanoLuc® Binary Technology (NanoBiT®)는 안정성과 낮은 효소 활성을 갖도록 최적화된 18kDa 크기의 Large BiT (LgBiT) subunit을 사용합니다. LgBiT에 상보적으로 결합하는 작은 펩타이드와 LgBiT이 결합하는 경우 기질과 반응하여 밝은 발광 signal을 생성하는 active enzyme이 만들어집니다. PPI 연구 시에는 LgBiT에 낮은 affinity로 결합하는 상보적인 펩타이드인 Small BiT (SmBiT, 11개 아미노산)을 사용합니다. 두 subunit은 타겟 단백질에 fusion 되었을 때 서로 결합하고 발광을 나타낼 수 있는 NanoBiT™ luciferase enzyme가 만들어지기 때문에 두 타겟 단백질이 결합한 경우에만 발광 signal이 생성됩니다. 이를 통해 단백질 association/disassociation kinetics를 감도 높게 측정할 수 있습니다. ACS Chemical Biology article에서 NanoBiT® technology에 대해 자세히 확인할 수 있습니다.

NanoBiT® system의 SmBiT/LgBiT subunit은 특정 항원 또는 항체를 측정할 수 있는 발광 기반의 Lumit™ technology에도 활용되었습니다. Lumit™ immunoassay는 각각의 항체에 SmBiT와 LgBiT을 화화적으로 라벨링하여 사용합니다. 라벨된 두 항체가 분석 물질과 결합하게 되면 이로 인해 SmBiT와 LgBiT이 서로 가까워져 결합하므로 active enzyme이 형성됩니다. 여기에 기질을 넣어주면 밝은 발광 signal이 생성됩니다. Lumit™ immunoassay는 분석 물질에 따라 direct, indirect, competitive binding format으로 개발되었습니다. Lumit Immunoassay가 signaling pathway에서의 변화 측정에 어떻게 활용되는지는 링크를 통해 확인할 수 있습니다.

NanoLuc® technology는 LgBiT와 high affinity로 결합하는 small subunit인 HiBiT을 개발하여 bioluminescent protein tagging system으로도 확장되었습니다. HiBiT 펩타이드와 LgBiT subunit은 자발적으로 결합하기 때문에 LgBiT이 포함된 detection 시약을 사용하여 HiBiT-tagging protein을 발광 기법으로 감도 높게 측정 가능합니다. 11개 아미노산의 작은 펩타이드인 HiBiT은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 내인성 locus에 HiBiT을 삽입하여 단백질 연구에 활용할 수도 있습니다. HiBiT 발광 펩타이드와 CRISPR 사용하는 방법에 대해 링크를 통해 확인할 수 있습니다. HiBiT tag은 단백질 양(protein abundance)와 단백질 역학(protein dynamics)을 정량적으로 측정할 수 있습니다. Anti-HiBiT mAb를 추가하면 HiBiT tag를 측정할 수 있는 가능성이 더 높아집니다.

NanoLuc® luciferase와 그 기능에 대해 자세히 알고 싶으신 경우 NanoLuc® Luciferase technology 페이지에서 관련 자료와 application을 추가적으로 확인하세요.