Cell Proliferation Assay, 다시 생각해볼 때
게시일 2026년 04월 30일
항암제의 효능을 평가할 때 세포 증식을 정확히 측정하는 것은 매우 중요합니다.
특히 CDK 4/6 inhibitor는 세포를 G1기에 arrest시키지만, 세포 자체의 성장(크기 증가)은 계속됩니다. 이로 인해 기존의 많은 세포 증식 분석법에서 실제와 다른 결과가 나올 수 있습니다.
일반적으로 사용되는 분석법들은 미토콘드리아 활성(ATP 수준), 총 세포 단백질, 또는 PRISM molecular barcoding 전략을 통한 mRNA 측정에 의존합니다. 이 지표들은 세포 성장에 따라 함께 증가하기 때문에, 세포 분열이 일어나지 않는 상황에서도 증식이 활발한 것처럼 잘못 해석될 수 있습니다. 최근 발표된 연구는 cell cycle arrest를 유도하는 약물 처리 후 metabolic assay가 보이는 이러한 한계를 실험적으로 입증하였습니다.
CDK 4/6 inhibitor 연구가 드러낸 기존 분석법의 한계
Foy et al.(2024)은 CDK 4/6 inhibitor의 항암 효능 평가 과정에서 기존 분석법의 한계를 명확히 보여주었습니다. CDK 4/6 inhibitor는 cell cycle을 효과적으로 차단하지만, 세포의 물리적 성장은 막지 못합니다. 세포 크기가 커지면 미토콘드리아 함량과 ATP 수준이 함께 상승하므로, ATP를 cell number의 대리 지표로 활용하는 assay에서는 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다.
연구진은 8종의 암세포주 패널에 CDK 4/6 inhibitor인 palbociclib 1 µM을 처리하고, CellTiter-Glo® 및 DNA content 기반의 CyQuant™으로 세포 증식을 평가하였습니다. 처리된 세포는 G1기에 머물면서도 크기가 커지고 미토콘드리아 함량이 증가하였습니다. 그 결과, CyQuant™ Direct로 측정한 DNA content에는 변화가 없었으나, ATP 수준은 오히려 증가한 것으로 나타났습니다.
CellTiter-Glo®는 NCI-60 스크리닝을 비롯한 대규모 cell viability 평가에 널리 활용되어 온 assay입니다. 그러나 이번 연구와 같이 cell cycle arrest가 유도되는 상황에서는 보다 적합한 분석법을 선택하는 것이 중요합니다.
새로운 세포 증식 분석법의 필요성
Foy et al.(2024)의 연구는 metabolism 기반 assay의 근본적인 문제점을 잘 보여줍니다. 기존의 다른 방법들도 번거로운 washing step이 필요하거나, 방사성 물질 또는 간접적인 마커에 의존하거나, 특수 장비를 필요로 하는 경우가 많습니다. 이를 해결하기 위해 Promega는 세포 증식의 대표적인 마커인 hKi-67을 직접 검출하는 Lumit® Cell Proliferation Assay (Human Ki-67)을 개발하였습니다.
Ki-67은 세포가 분열 중일 때 발현되는 마커로, 세포의 대사 상태와는 무관합니다. 따라서 CDK 4/6 inhibitor처럼 대사 활성은 유지하면서 분열만 차단하는 약물의 효능 평가에 특히 적합합니다. 이 assay는 no-wash, add-and-read 방식으로 실험 시간을 단축하고, CyQuant™ 대비 증식 변화를 더 이른 시점에 감지할 수 있습니다.
Figure 1. HCT 116 cell(96-well plate, 10,000 cells/well)에 antiproliferative agent nutlin-3A를 농도별로 처리한 결과, cytotoxicity는 유발되지 않았으며 Ki-67 발현 수준이 dose-dependent하게 감소하였다. Ki-67 수준은 Lumit® Cell Proliferation Assay (Human Ki-67)로 측정하였고, viable cell number의 변화는 parallel assay plate에서 CyQuant™ Direct로 확인하였다.
이 assay는 Lumit® technology를 기반으로 합니다. 표지된 primary antibody들이 hKi-67 존재 시 기능적인 NanoBiT® luciferase 효소를 형성하며, substrate 첨가 후 발생하는 luminescent signal이 Ki-67 발현 수준에 비례합니다(Figure 2).
Figure 2. Lumit® Cell Proliferation Assay (Human Ki-67)의 작동 원리.
hKi-67 단백질이 존재할 때 표지된 primary antibody pair가 기능적 NanoBiT® luciferase를 형성하고, substrate 첨가 시 Ki-67 발현 수준에 비례하는 luminescent signal이 생성된다.
이번 연구는 metabolic activity 기반 assay가 세포 증식이 아닌 세포 성장을 반영할 수 있음을 잘 보여주며, assay 선택의 중요성을 다시금 상기시킵니다. Promega의 Lumit® Cell Proliferation Assay (Human Ki-67)은 대사 상태에 독립적인 Ki-67을 직접 측정함으로써, 세포 증식 결과의 해석에 대한 신뢰도를 높입니다. Promega는 Cell Health 관련 연구에 필요한 다양한 솔루션을 지속적으로 개발하고 있습니다.
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